pDsRed1-C3/XAPC7真核表达载体的构建及细胞定位

目的:构建pDsRed1-C3/XAPC7真核表达载体并观察其在786-O、293T和Chang liver细胞株中的定位情况。方法:采用RT-PCR法从HBE135-E6E7细胞株中克隆得到XAPC7cDNA全长序列,将之与pMD18T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中。构建好的pD-sRed1-C3/XAPC7真核表达质粒经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染786-O、293T和Chang liver细胞株中,观察其在真核细胞中的表达。结果:pDsRed1-C3/XAPC7重组子经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功,转染该重组子的细胞株均可见红色荧光蛋白的表达,呈颗粒状分布。XAPC7主要定位于786-O细胞的胞质,胞核罕见,在293T细胞中,胞质和胞核均有分布,且两者间无明显差别,在Changliver细胞中,胞质和胞核亦均有分布,但以胞质为主。结论:成功构建pDsRed1-C3/XAPC7融合基因并进行真核表达,发现XAPC7在不同细胞中的细胞定位具有差异,为下一步研究XAPC7的肿瘤相关功能奠定基础。

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达。方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平。结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达。结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础。

人基因XAPC7在肺腺癌细胞及组织中的表达和定位

目的了解XAPC7在肺腺癌细胞和组织中的表达及定位情况,为后续的功能研究提供线索。方法首先采用Western-blot技术检测XAPC7在HBE135-E6E7正常支气管上皮细胞株、A549肺腺癌细胞株、NCI-H446小细胞肺癌细胞株中的表达;再用细胞免疫荧光技术,以HBE135-E6E7和A549细胞为研究对象,用鼠抗人XAPC7单克隆抗体分析该蛋白的细胞定位情况;最后利用免疫组织化学法随机检测34例肺腺癌及相应癌旁组织中XAPC7蛋白的定位及表达。结果 Western-blot显示:与HBE135-E6E7相比,XAPC7在NCI-H446中表达明显降低(P<0.05),在A549中表达有所增加,但差异无统计学意义(P>0.05)。激光共聚焦显微镜观察发现XAPC7在A549中主要定位于细胞浆,胞核中少见,而在HBE135-E6E7中除胞浆外,胞核中也有较多分布。免疫组化显示:XAPC7在肺腺癌和肺鳞癌组织细胞的胞浆和胞核中均有表达。在34例肺腺癌中,癌组织胞浆中XAPC7蛋白的表达明显高于癌旁组织胞浆的表达(Z=-4.341,P=0.000),而在癌组织与癌旁组织的胞核中XAPC7蛋白的表达差异无统计学意义(Z=-0.167,P=0.867)。另外,XAPC7蛋白的表达与年龄、性别、肿瘤大小、组织分化和有无淋巴结转移无关(P均>0.05)。结论 XAPC7在肺腺癌细胞株中有表达,主要定位于胞浆。在肺腺癌组织和癌旁组织胞浆中的表达差异有统计学意义,为后续研究打下了基础。