内质网应激IRE1α/XBP-1通路在多巴胺能神经元变性死亡中的作用

目的探讨内质网应激1型跨膜蛋白激酶α(IRE1α)/X盒结合蛋白1(XBP-1)通路在多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法利用内质网应激诱导剂Thapsigargin观察小鼠原代成纤维细胞中IRE1α/XBP-1通路活性。利用IRE1α抑制剂KIRA8探究IRE1α/XBP-1通路在原代中脑多巴胺能神经元变性死亡中作用。结果相比于未处理组细胞,Thapsigargin处理后原代成纤维细胞中内质网应激IRE1α/XBP-1通路明显上调。Thapsigargin处理可显著降低原代中脑多巴胺能神经元的存活率,而KIRA8处理可显著改善Thapsigargin导致的多巴胺能神经元存活率降低。结论内质网应激通过IRE1α/XBP-1通路介导多巴胺能神经元的变性死亡。

平喘宁调节IRE-1α-XBP-1s信号轴干预哮喘大鼠气道炎症的机制研究

目的:探究平喘宁对哮喘大鼠气道炎症的防治作用及机制。方法:将105只雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、地塞米松组、桂龙咳喘宁组、平喘宁高剂量组、平喘宁中剂量组、平喘宁低剂量组,每组15只。以卵清蛋白联合氢氧化铝复制大鼠哮喘模型,造模21 d后,各给药组分别灌胃给予相应药物,正常组、模型组灌胃给予等体积的生理盐水,1次/d,连续4周。4周后,在进行哮喘激发试验后2 h内解剖大鼠并取出肺组织,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。HE染色观察肺组织中平滑肌厚度、炎症细胞浸润程度等相应病理的改变;ELISA法检测BALF中IL-5、IL-17水平;RT-qPCR法检测肺组织IRE-1αmRNA、XBP-1s mRNA、NF-κB p65 mRNA、Hgsnat mRNA、Pdgfrb mRNA、Scara3 mRNA相对表达量;Western blotting法检测肺组织中IRE-1α、XBP-1s、NF-κB p65蛋白相对表达量。结果:HE染色结果显示,与模型组比较,各给药组(平喘宁低剂量组、平喘宁中剂量组、平喘宁高剂量组、地塞米松组、桂龙咳喘宁组)大鼠肺组织病理情况都有不同程度的缓解。ELISA结果显示,与正常组比较,模型组大鼠BALF中IL-5、IL-17水平均明显升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组大鼠BALF中IL-5、IL-17水平均明显降低(P<0.01),且平喘宁具有剂量依赖性;平喘宁低、中剂量组大鼠BALF中IL-5、IL-17水平均高于地塞米松组和桂龙咳喘宁组(P<0.01);平喘宁高剂量组大鼠BALF中IL-5水平明显高于地塞米松组和桂龙咳喘宁组(P<0.01),而IL-17水平与地塞米松组和桂龙咳喘宁组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。RT-qPCR结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肺组织IRE-1αmRNA、XBP-1s mRNA、NF-κB p65 mRNA相对表达量均明显升高(P<0.01),Hgsnat mRNA、Pdgfrb mRNA、Scara3 mRNA相对表达量均明显降低(P<0.01);与模型组比较,各给药组大鼠肺组织IRE-1αmRNA、XBP-1s mRNA、NF-κB p65 mRNA相对表达量均明显降低(P<0.01),Hgsnat mRNA、Pdgfrb mRNA、Scara3 mRNA相对表达量均明显升高(P<0.05或P<0.01);平喘宁低剂量组大鼠肺组织IRE-1αmRNA、XBP-1s mRNA、NF-κB p65 mRNA相对表达量均明显高于地塞米松组和桂龙咳喘宁组(P<0.01),Hgsnat mRNA、Pdgfrb mRNA、Scara3 mRNA相对表达量均明显低于地塞米松组和桂龙咳喘宁组(P<0.01);平喘宁中剂量组大鼠肺组织XBP-1s mRNA、NF-κB p65 mRNA相对表达量均明显高于地塞米松组和桂龙咳喘宁组(P<0.01),Hgsnat mRNA、Pdgfrb mRNA、Scara3 mRNA相对表达量均明显低于地塞米松组和桂龙咳喘宁组(P<0.05或P<0.01),而IRE-1αmRNA相对表达量与地塞米松组和桂龙咳喘宁组比较,差异无统计学意义(P>0.05);平喘宁高剂量组大鼠肺组织IRE-1αmRNA相对表达量均明显低于地塞米松组和桂龙咳喘宁组(P<0.01),而Hgsnat mRNA、Pdgfrb mRNA相对表达量均明显高于地塞米松组(P<0.01);平喘宁高剂量组Hgsnat mRNA、Pdgfrb mRNA相对表达量与桂龙咳喘宁组比较,差异无统计学意义(P>0.05),XBP-1s mRNA、NF-κB p65 mRNA、Scara3 mRNA与地塞米松组和桂龙咳喘宁组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Western blotting结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肺组织IRE-1α、XBP-1s、NF-κB p65蛋白相对表达量均明显升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组大鼠肺组织IRE-1α、XBP-1s、NF-κB p65蛋白相对表达量均明显降低(P<0.01);平喘宁低剂量组大鼠肺组织IRE-1α、XBP-1s、NF-κB p65蛋白相对表达量均明显高于地塞米松组和桂龙咳喘宁组(P<0.01);平喘宁中剂量组大鼠肺组织XBP-1s、NF-κB p65蛋白相对表达量均明显高于地塞米松组和桂龙咳喘宁组(P<0.05或P<0.01),IRE-1α蛋白相对表达量明显高于桂龙咳喘宁组(P<0.05),而IRE-1α蛋白相对表达量与地塞米松组比较,差异无统计学意义(P>0.05);平喘宁高剂量组大鼠肺组织IRE-1α、XBP-1s、NF-κB p65蛋白相对表达量与地塞米松组和桂龙咳喘宁组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:平喘宁可通过调节IRE-1α-XBP-1s信号轴改善OVA诱导的哮喘大鼠气道炎症性损伤。

XBP-1和ERα存在相互作用

雌激素受体α(ERα)是乳腺癌治疗的靶标和预后的指标。在乳腺癌中 ,人X盒结合蛋白 1(XBP_1)与ERα共表达 ,并在一些乳腺肿瘤中过表达。这些结果提示 ,XBP_1与ERα可能存在相互作用。XBP_1由于剪切方式不同 ,产生两种形式的XBP_1,即XBP_1S和XBP_1U。体外GST沉淀实验表明 ,XBP_1S和XBP_1U均能结合ERα ,XBP_1S的结合能力大于XBP_1U。体内免疫共沉淀实验也表明 ,XBP_1S和XBP_1U以激素不依赖的方式与ERα结合。ERα通过其DNA结合结构域与XBP_1S和XBP_1U结合 ,而XBP_1S和XBP_1U通过其N末端的亮氨酸拉链结构域和C末端的转录激活结构域与ERα相互作用。这些结果提示 ,XBP_1S和XBP_1U可能通过与ERα的相互作用参与雌激素受体信号途径。

过表达XBP-1的不同剪切体对骨髓瘤细胞分化的影响

本研究探讨XBP-1的两种不同剪切体XBP-1u,XBP-1s在骨髓瘤诱导分化过程中的作用机制。分别构建过表达质粒pcDNA3.1-C-XBP-1u,pcDNA3.1-C-XBP-1s,转染进入骨髓瘤细胞系U266和RPMI-8226细胞。光学显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面CD49e的表达率,ELISA检测上清液中轻链蛋白含量的改变以判断细胞的分化程度,Western blot检测XBP-1u和XBP-1s表达水平的变化。结果表明:过表达XBP-1u可以促进骨髓瘤细胞的分化,在形态学上显示浆细胞更加成熟;在U266和RPMI-8226细胞中,细胞表面CD49e的阳性表达率也明显上调,分别由对照的(9.02±0.3)%,(5.17±0.92)%增加到(27.7±1.14)%,(13.97±1.79)%(p<0.01)。U266和RPMI8226细胞培养上清中的轻链蛋白含量由对照的(474.75±19.52)ng/ml,(289.44±6.19)ng/ml增加到(692.34±21.17)ng/ml,(401.55±13.7)ng/ml(p<0.01,p<0.05),而在过表达XBP-1s的骨髓细胞中则没有明显的改变,表明过表达XBP-1s对骨髓瘤细胞的分化没有促进作用。结论:XBP-1u表达水平的增高对于骨髓瘤细胞的分化具有重要作用。

XBP-1在乳腺癌细胞株中的表达及其在ERα信号途径中的作用

雌激素受体 (ERα)在乳腺癌的发生发展过程中起重要作用。在乳腺癌中 ,人X盒结合蛋白 1(XBP 1)与ERα共表达 ,并在一些乳腺肿瘤中过表达。最近发现XBP 1有两种剪切形式 ,即XBP 1S和XBP 1U ,但它们在乳腺癌细胞中的表达形式和在ERα信号途径中的作用还不清楚。采用RT PCR技术 ,检测到XBP 1的两种剪切形式在正常乳腺细胞株和不同乳腺癌细胞株中均表达。利用ERE LUC报告基因 ,检测XBP 1S和XBP 1U在乳腺癌细胞株MDA MB 4 35中对ERα转录活性的影响表明 ,它们均以激素不依赖但以XBP 1剂量依赖的形式提高ERα的转录活性 ,XBP 1S的活性高于XBP 1U。XBP 1S和XBP 1U高效提高ERE LUC报告基因的活性依赖于ERα的存在。结果提示 ,XBP 1S和XBP 1U可能通过ERα信号途径在乳腺癌的发生发展中起重要作用。

Xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导骨髓瘤细胞株NCI-H929(H929)凋亡的影响。通过小发夹RNA(shRNA)干扰xbp-1基因表达,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测靶细胞凋亡率,采用Wes-ternblot检测XBP-1蛋白水平。结果表明:通过慢病毒载体PLL3.7介导的xbp-1 shRNA表达,能有效抑制H929细胞XBP-1蛋白表达,xbp-1 shRNA表达细胞的凋亡率显著高于对照组[(10.13±0.61)%vs(2.5±0.2)%,p<0.05];经硼替佐米处理后,xbp-1基因功能缺陷的H929细胞的凋亡率显著高于空载体组[(45.07±1)%vs(2.73±0.25)%,p<0.05]。结论:xbp-1基因沉默能够显著增强硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡活性。

内质网应激IRE-1/XBP-1参与调控肝癌进展的机制研究

目的探讨内质网应激(ERS)调控内质网核信号转导蛋白a1(Endoplasmic reticulum to nucleus signaling 1,IRE-1) IRE-1/X-盒-结合蛋白-1(X box Binding Protein 1,XBP-1) XBP-1参与肝癌进展的机制研究。方法用无水乙醇诱导正常肝细胞LO2、高分化肝癌细胞株Hep G2及高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞48 h获得内质网应激细胞模型;采用CCK-8法检测细胞的增殖情况;采用Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况;采用Real-time PCR和Western blot方法检测无水乙醇处理前后IRE-1、XBP-1、DNA损伤诱导基因153(CHOP)、Cleaved-caspase 12和Bcl-2 mRNA和蛋白含量表达。结果无水乙醇诱导LO2、Hep G2、和SMMC-7721细胞发生内质网应激后,细胞存活率显著降低,细胞凋亡明显升高,差异有统计学意义(P <0. 05)。无水乙醇诱导LO2、Hep G2、和SMMC-7721细胞发生内质网应激后,LO2、Hep G2、和SMMC-7721细胞内IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12 mRNA和蛋白表达含量显著升高,其中细胞内mRNA和蛋白含量表达的高低次序为SMMC-7721、Hep G2和LO2细胞,差异有统计学意义(P <0. 05); Bcl-2 mRNA和蛋白表达含量显著降低,细胞内mRNA和蛋白含量表达的高低次序为LO2、Hep G2和SMMC-7721细胞,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论内质网应激发生后LO2、Hep G2和SMMC-7721细胞中IRE-1/XBP-1的表达水平显著升高,有效参与调控肝癌细胞的增殖发展。

大鼠局灶性脑缺血预处理后XBP-1表达的变化

目的观察缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注后X盒结合蛋白1(XBP-1)mRNA及其蛋白表达的影响。方法 SD大鼠60只,随机分为假手术组(SO)、脑缺血再灌注组(MCAO)、脑缺血预处理组(BIP)3组,每组按照再缺血后12h、1d、2d、3d 4个时间点分为4个亚组。采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用实时荧光定量PCR和Western blot法观察再缺血后各个时间点XBP-1 mRNA及其蛋白的表达变化。结果 MCAO组XBP-1 mRNA及其蛋白表达均于缺血再灌注后12h开始明显上升,24h达高峰(P<0.01),随再灌注时间延长其表达逐渐下降,但仍保持较高表达水平(P<0.01);BIP组较MCAO组XBP-1 mRNA及其蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论脑缺血预处理可能通过诱导XBP-1表达发挥其神经保护作用。

清热化瘀颗粒对脑缺血预处理大鼠XBP-1表达的影响

目的观察清热化瘀颗粒对脑缺血预处理大鼠缺血再灌注后XBP-1 mRNA及其蛋白表达的影响。方法 SD大鼠80只,随机分为假手术组(SO)、脑缺血再灌注组(MCAO)、脑缺血预处理组(BIP)、清热化瘀颗粒组(QRHY),每组按照再缺血后12h、1d、2d、3d 4个时间点分为4个亚组。采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用实时荧光定量PCR和Western blot法观察再缺血后各个时间点XBP-1 mRNA及其蛋白的表达变化。结果 MCAO组XBP-1 mRNA及其蛋白表达均于缺血再灌注后12 h开始明显上升,24 h达高峰(P<0.01),随再灌注时间延长其表达逐渐下降,但仍保持较高表达水平(P<0.01);BIP组较MCAO组XBP-1 mRNA及其蛋白表达明显升高(P<0.05或P<0.01),QRHY组较BIP组进一步升高其表达(P<0.05)。结论脑缺血预处理可能通过诱导XBP-1表达发挥其神经保护作用,清热化瘀颗粒可促进其作用。

糖络宁对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经功能及内质网应激IRE1α-XBP-1-CHOP通路的影响

目的探讨糖络宁对糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)大鼠内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)IRE1α-XBP-1-CHOP通路的影响。方法建立DPN大鼠模型,设置空白对照组(Control)、模型对照组(Model)、氧化三甲胺组(TMAO)、糖络宁低剂量组(LTLN)和糖络宁高剂量组(HTLN),分别灌胃给药12周。采用放射免疫试剂盒测定稳态胰岛素抵抗指数;采用透射电镜和劳克坚劳蓝染色观察坐骨神经结构;测定鼠尾热痛阈值、神经传导速度和蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5, PGP 9.5)蛋白的表达并检测周围神经功能;采用Western blot法检测葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP 78)、X盒结合蛋白1(X-box binding protein1, XBP-1)、凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein Homologous protein, CHOP)、B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)和磷酸化真核翻译起始因子2α(phospho-ukaryotic translation initiation factor 2α, P-eIF 2α)的蛋白表达;通过免疫荧光组织化学法检测肌醇激酶1 (inositol requiring enzyme1α, IRE 1α)、生长停滞及 DNA损伤基因34 (growth-arrest and DNA damage-inducible gene 34, GADD 34)和内质网氧化蛋白(endoplasmic oxidoreductin-1-like, Ero1α)指标。结果与模型组比,糖络宁高、低剂量组能够有效改善坐骨神经的结构和功能,并能够影响内质网应激IRE1α-XBP-1-CHOP凋亡通路提高GRP 78、Bcl-2和P-eIF 2α的表达(P<0.05),降低P-IRE1α、XBP-1、CHOPGADD 34、Bax和Ero1α的表达(P<0.05)。结论糖络宁能够通过抑制ER stress中IRE1α-XBP-1-CHOP凋亡途径相关蛋白的表达,从而减轻ER stress诱导的细胞凋亡,改善坐骨神经的结构和功能从而防治DPN。

XBP-1在肿瘤发生发展中的研究进展

X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP-1)是一种新近发现的与蛋白质折叠和内质网构建相关的蛋白质,研究发现其在多种肿瘤细胞中均有广泛表达,与肿瘤发生、发展的关系密切。本文对XBP-1参与肿瘤发生、发展过程的免疫逃避、血管生成、缺氧、侵袭转移等方面的研究进展做一综述。

转录因子XBP1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

人X盒结合蛋白 1(XBP 1)为一种转录因子 ,与多种肿瘤的发生、发展有密切关系 .XBP 1有2种剪切形式 ,即XBP 1S和XBP 1U .将这 2种剪切形式中的一段相同编码序列 (编码 82～ 14 7位氨基酸 )重组于谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合蛋白表达载体pGEX KG中 ,构建成重组质粒pGST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 ) .将该重组质粒转化E .coliDH5α后 ,表达GST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 )融合蛋白 ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析获得纯化的融合蛋白 .用此融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 .利用制备的抗体分别用Western印迹和免疫细胞化学检测XBP 1的 2种剪切形式在哺乳动物细胞中的表达 .结果表明 ,该抗体对XBP 1的 2种剪切形式均具有反应原性 ,效价高 ,特异性好 ,可以用于进一步研究XBP

X-盒结合蛋白1的生理及病理生理学作用

X-盒结合蛋白1(XBP-1)是未折叠蛋白反应的重要组分,有剪接型XBP-1(XBP-1S)和非剪接型XBP-1(XBP-1U)两种形式。当细胞处于内质网应激状态时,XBP-1由活化转录因子6(ATF6)诱导,经IRE1α非传统剪接,转录有功能的XBP-1S,活化未折叠蛋白反应。XBP-1是一种重要的转录因子,对细胞生长和分化具有重要调控作用,并与人类多种疾病的发生和发展相关。

内质网应激相关因子X-盒结合蛋白-1在人体肝癌组织中的表达

目的研究内质网应激(ERS)相关因子X-盒结合蛋白(XBP)-1在肝癌组织中的表达情况,以此证实肝癌演进中是否存在ERS反应的活化。方法病理学诊断确定的45例肝癌组织、15例癌旁组织和15例正常肝组织,采用逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)和Western印迹法检测XBP-1 mRNA和蛋白表达。结果 RT-PCR结果表明,肝癌组织中XBP-1 mRNA表达(0.444 6±0.035 7)显著高于癌旁组织(0.421 8±0.033 8)、正常肝组织(0.402 7±0.026 9)(P<0.05)。Western印迹结果表明肝癌组织中XBP-1蛋白的表达量显著高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.05)。结论肝癌发生及发展过程中存在ERS反应的激活。

X-盒结合蛋白1在食管癌癌组织中的表达及对食管癌生物学行为的影响

目的观察X-盒结合蛋白1在食管癌组织中的表达及对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法 60例食管癌与癌旁组织,分别以Real-time PCR、western-blot、免疫组化检测XBP-1表达情况。在TE-1细胞系中,转染pcDNA3.1-XBP-1,检测TE-1细胞增殖、迁移、侵袭能力变化。结果 Real-time PCR检测结果显示,食管癌组织中XBP-1 mRNA水平显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Western-blot检测结果显示,食管癌组织中XBP-1蛋白表达水平显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。60例食管癌组织中,48例呈阳性表达,12例呈阴性表达。60例癌旁组织中,15例呈阳性表达,45例呈阴性表达。食管癌组织中XBP-1阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0.05)。在TE-1细胞中,转染pcDNA3.1-XBP-1组细胞增殖率显著高于空白对照组及空载对照组(P<0.05)。TE-1细胞中,转染pcDNA3.1-XBP-1后迁移细胞数、侵袭细胞数均显著多于转染pcDNA3.1及空白对照组(P<0.05)。结论 XBP-1在食管癌中表达量显著高于癌旁组织,转染XBP-1基因可促进食管癌细胞TE-1增殖、迁移、侵袭。

水稻干尖线虫X-box结合蛋白基因克隆及功能

水稻干尖线虫不仅危害水稻等草本农作物,还侵染印度榕等乔本植物,对农林植物危害严重。为开发新的生物防治技术、鉴定具有生防潜力的基因,克隆了水稻干尖线虫X-box结合蛋白基因Ab-xbp-1。通过RNAi技术验证苏云金芽孢杆菌处理过程中Ab-xbp-1基因在水稻干尖线虫先天免疫激活过程中所起的作用。结果表明:Ab-xbp-1基因沉默后水稻干尖线虫免疫力下降,这一结果说明该基因具有生物防治潜力。

肿瘤坏死因子α诱导ATF6、IRE1介导的未折叠蛋白反应

目的研究肿瘤坏死因子α(TNFα)对小鼠纤维母细胞(L929)中葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatedprotein78,GRP78)、X盒结合蛋白1(X box binding protein 1,XBP-1)表达的影响,探讨TNFα信号传导通路与内质网应激的相关性。方法体外培养L929细胞,分别用TNFα、Tunicamycin作用0、24、、68、和10 h,以Western Blot、Northern Blot检测内质网应激的标志分子:GRP78蛋白的表达,以及非折叠蛋白反应中的关键分子:XBP-1蛋白及mRNA水平表达;用RT-PCR结合Pst1酶切法检测XBP-1 mRNA的剪接作用。结果TNFα作用于L929细胞即可以引起GRP78蛋白、XBP-1蛋白及XBP-1mRNA表达的升高,又可以诱导XBP-1mRNA的剪接作用;且这些分子表达的升高及mRNA的剪接作用均发生在TNFα作用的早期(开始于TNFα作用的2 h,4 h达到高峰,6 h后逐渐减弱)。结论TNFα作用于L929细胞可以诱导内质网应激,由此引起的活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、ER转膜蛋白激酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)介导的未折叠蛋白反应对细胞具有促生存作用。

ERO1α介导同型半胱氨酸诱导的肝细胞内质网应激

目的:探讨内质网氧化还原酶-1α(endoplasmic reticulum oxidoreductin 1α,ERO1α)在同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导的肝细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)中的作用及机制.方法:培养人肝细胞,用Hcy(100μmol/L)干预,同时设对照组,使用酶联免疫法(ELISA)检测ERS相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulated protein 78,GRP78)、X盒结合蛋白-1(X-box binding protein-1,XBP-1)、内质网类似激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic r e t i c u l u m k i n a s e,P E R K)及激活转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)的水平;用不同浓度Hcy(0、50、100、200、500μmol/L)和100μmol/L Hcy+叶酸+维生素B12(VB12)干预,运用实时定量PCR和Western blot检测ERO1αm RNA和蛋白水平;构建ERO1α基因重组质粒和RNA干扰片段并感染肝细胞,检测ERO1αm RNA和蛋白表达变化;采用ELISA法检测其对ERS相关蛋白的调控作用.结果:与对照组比较,Hcy组GRP78、ATF6、P E R K、X B P-1水平升高(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.01);不同浓度Hcy干预后,肝细胞内ERO1αm RNA及蛋白水平呈下降趋势,且随着Hcy浓度的增加而减少(P<0.01),呈剂量依赖关系;将ERO1α重组质粒转染肝细胞后,ERO1αm RNA及蛋白表达明显增加(P<0.01);将三个不同的ERO1αsi RNA片段转染肝细胞后,ERO1αm RNA及蛋白表达降低(P<0.01),其中si RNA2作用最明显(P<0.01);与Hcy组相比,Hcy+p ERO1α组GRP78、XBP-1、PERK及ATF6均明显降低(P<0.01),而Hcy+si RNA2组均明显升高(P<0.01).结论:Hcy可能通过下调ERO1α引起肝细胞GRP78-XBP-1/PERK/ATF6表达增加促进ERS发生.

内质网应激通路需肌醇酶1α/X盒结合蛋白1在中性粒细胞弹力蛋白酶诱导的气道黏液分泌中的作用

目的·探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反应在中性粒细胞弹力蛋白酶(neutrophil elastase,NE)诱导人气道上皮细胞黏蛋白5AC(mucin 5AC,MUC5AC)分泌中的作用及机制。方法·培养人气道上皮细胞HBE16,分别给予活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)预处理,或分别转染需肌醇酶1α(inositol-requiring kinase 1α,IRE-1α)小干扰RNA(siRNA)、X盒结合蛋白1(X-boxbinding protein 1,XBP-1)siRNA,再予以NE刺激;同时设单纯NE组和空白对照组。试剂盒检测ROS的生成水平;Westernblotting检测干预后ERS相关信号分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,pPERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、磷酸化IRE-1α(pIRE-1α)及XBP-1蛋白表达量的变化;实时荧光定量PCR检测剪切的XBP-1(XBP-1s)mRNA水平;ELISA和免疫荧光检测MUC5AC在各组细胞中的蛋白表达情况。结果·与空白对照组相比,NE刺激24 h后细胞ROS含量增加,GRP78、ATF6、pPERK及pIRE-1α蛋白水平均显著升高(均P<0.05),XBP-1s mRNA及蛋白表达也明显增加(均P<0.05),同时MUC5AC蛋白表达增加(均P<0.05);NAC及4-PBA预处理后均使上述ERS相关蛋白表达较单纯NE组降低(均P<0.05),MUC5AC蛋白水平降低(均P<0.05);转染IRE-1αsiRNA或XBP-1 siRNA,细胞中MUC5AC蛋白表达也较单纯NE组明显降低,同时XBP-1s mRNA及蛋白表达也有明显下降(均P<0.05)。结论·NE通过产生ROS引起ERS反应,诱导MUC5AC蛋白表达及分泌增加,ERS通路IRE-1α/XBP-1在其中发挥着一定的作用。

蛋白酶体抑制剂通过内质网应激诱导DU145细胞凋亡机制的探讨

目的探讨蛋白酶体抑制剂(EPO)诱导前列腺癌DU145细胞凋亡机制是否与内质网应激(Er-stress)有关。方法用不同浓度的EPO处理DU145细胞,MTS检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Er-stress相关分子同源蛋白质(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、X盒结合蛋白1(XBP-1)、剪接型X盒结合蛋白1信使核糖核酸(XBP-1s m RNA);Western blot检测CHOP和GRP78的表达。结果 EPO抑制DU145细胞生长,并且呈现浓度梯度依赖性,处理组细胞凋亡率高于未处理组,高剂量组凋亡率高于低剂量组。EPO处理后,CHOP、剪接型X盒结合蛋白1(XBP-1s)、GRP78 m RNA明显升高,72 h最明显。低剂量组与高剂量组48 h CHOP和XBP-1s的表达比较差异均有统计学意义,两组48和72 h GRP78比较差异均有统计学意义。EPO处理后,XBP-1和XBP-1s基因转录水平升高,而XBP-1s随处理时间增长基因转录水平变化不明显。EPO处理后,CHOP和GRP78不断增加,72 h两种蛋白质均达到最高值,并且低剂量组与高剂量组在72 h比较差异有统计学意义。结论 EPO能抑制DU145细胞生长,诱导凋亡,其机制可能与激活Er-stress,诱发内质网的相关分子CHOP、XBP-1s、XBP-1、GRP78的表达有关。