IRE1α/Xbp1s靶向调控NKp46改善NK细胞杀伤功能清除HIV感染细胞的思路探析

自然杀伤细胞的杀伤活性无MHC限制,不依赖抗体,是抵御肿瘤和病毒感染的第一道防线。肿瘤或慢性病毒感染后,固有免疫NK细胞与适应性免疫T细胞共同发挥免疫功能对抗肿瘤及感染,但由于免疫系统无法迅速根除病灶,免疫细胞内质网稳态被打破,使其无法发挥正常的免疫杀伤及清除功能,导致病情迅速恶化甚至死亡。NKp46是仅表达在NK细胞上的特异性活化受体,它直接影响NK细胞的活化程度与杀伤作用的强弱。艾滋病是一种目前无法根治的慢性传染病之一,病毒持续感染引起NK细胞内质网应激,IRE1α/Xbp1s信号通路的启动导致NKp46蛋白翻译大部分被抑制,影响NK细胞活化发挥功能,因此基于IRE1α/Xbp1s靶向调控NKp46寻求改善NK细胞杀伤功能的新靶点成为研究的新思路。

内质网应激分子XBP1S在1型糖尿病大鼠认知功能障碍中作用探讨

目的:本研究通过观察tau蛋白和内质网应激通路关键分子XBP1S在糖尿病大鼠海马表达的变化,探讨XBP1S在糖尿病大鼠脑认知功能障碍的作用.方法:大鼠经腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立1型糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠模型,注射STZ16周末,取大鼠海马组织,采用Western Blots和免疫组织化学方法 ,观察大鼠海马组织中XBP1S和Tau的变化.结果:注射STZ16周,Western Blots结果显示:糖尿病大鼠海马组织中XBP1S蛋白表达明显降低,Tau蛋白表达明显升高;免疫组织化学染色结果显示:DM大鼠海马CA1区Tau阳性细胞数较多,颜色深;DM大鼠海马CA1区XBP1阳性细胞数较少,颜色浅.结论 :XBP1S在DM大鼠海马区表达比正常大鼠减少,提示XBP1S在可能参与糖尿病大鼠认知损伤.

芪地糖肾方抑制IRE1α/XBP1s改善高糖诱导足细胞内质网应激的研究

目的观察芪地糖肾方通过肌醇依赖酶1α(IRE1α)/剪接型x-框结合蛋白1(XBP1s)抑制高糖诱导的条件永生化小鼠足细胞(MPC5)内质网应激(ERS)的作用。方法以MPC5细胞为研究对象,采用CCK-8法检测细胞活力筛选高糖造模浓度和时间以及中药干预浓度。将MPC5细胞分为正常组、模型组、芪地糖肾方组,分别予完全培养基、35 mmol/L高糖培养基、35 mmol/L高糖培养基+芪地糖肾方冻干粉溶液培养,采用Western blot法检测足细胞中硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)及ERS相关通路IRE1α、p-IRE1α、XBP1s、蛋白激酶RNA样ER激酶(PERK)、p-PERK、激活转录因子6(ATF6)蛋白表达变化。结果与正常组比较,模型组MPC5细胞p-IRE1α/IRE1α、p-PERK/PERK、XBP1s、TXNIP、NLRP3蛋白表达水平升高(P<0.01,P<0.05),ATF6表达升高,但差异无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,芪地糖肾方组能够显著下调高糖诱导的MPC5细胞p-IRE1α/IRE1α、XBP1s、TXNIP、NLRP3蛋白表达水平(P<0.01,P<0.05),但p-PERK/PERK、ATF6蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论芪地糖肾方可以通过抑制IRE1α/XBP1s途径过度活化,减少下游TXNIP和NLRP3过度表达,从而改善高糖诱导的足细胞内质网应激。

XBP1s调控炎症诱导的成牙本质细胞自噬

目的:探讨转录因子剪接型X-盒结合蛋白1(spliced X-box binding protein 1,XBP1s)对炎症诱导的成牙本质细胞自噬的作用。方法:免疫组化检测XBP1和自噬指标LC3在健康和炎症牙髓组织中的表达。利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠牙乳头细胞系(mDPC6T)建立体外炎症模型,检测XBP1和自噬指标LC3、ATG5的表达,再分别利用抑制剂KIRA6,和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)清除剂NAC处理细胞。通过免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测XBP1s、LC3和ATG5等指标的表达。结果:XBP1s和LC3在炎症牙髓的成牙本质细胞层中表达升高。LPS可诱导XBP1s在mDPC6T细胞中表达,与LC3、ATG5等自噬指标的表达趋势相似。抑制XBP1s可降低LC3、ATG5等自噬指标的表达。结论:XBP1s可调控炎症诱导的成牙本质细胞自噬。

转录因子XBP1S基因表达谱差异分析

目的 应用基因表达谱芯片技术了解XBP1S在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法 构建pcDNA3.1（-）-XBP1S真核表达载体,转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1（-）处理相同细胞系作为对照.48 h后制备细胞裂解液,提取mRNA,应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行基因表达谱芯片技术分析.经过差异基因表达谱的筛选,发现HepG2细胞转染XBP1S以后,有38个基因表达水平显著上调,30个基因表达水平显著下调.结论 成功构建XBP1S的真核表达载体pcDNA3.1（-）-XBP1S,运用基因表达谱芯片技术成功筛选了XBP1S转染细胞后的差异表达基因,这些差异表达基因包括细胞周期、蛋白质的翻译合成及运输、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号转导等方面起重要作用及肿瘤发生相关的基因,为进一步阐明XBP1S可能存在的调控机制及XBP1S蛋白可能的生物学功能提供理论依据.

XBP1s条件性过表达定点敲入小鼠模型的建立

目的获得可进行条件性过表达XBP1s基因的Rosa 26定点敲入杂合子小鼠。方法通过In-Fusion Cloning的方法构建胚胎干细胞(ES细胞)打靶载体,并进行线性化,电转染JM8A3 ES细胞。药物筛选获得抗性ES细胞克隆,经长片段PCR鉴定获得正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞经克隆扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合鼠,筛选出高比例嵌合小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得阳性F1代小鼠,并分别进行PCR和测序鉴定。结果经酶切鉴定证明打靶质粒构建成功,经胚胎干细胞打靶共获得144个抗性ES细胞克隆,通过长片段PCR的方式对同源重组阳性克隆进行筛选和克隆经测序确认,共获得21个正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞克隆E3、C6经扩增后注射C57BL/6J小鼠囊胚96个,通过胚胎移植,共获得2只高嵌合雄鼠,与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得3只F1代杂合小鼠,经PCR及测序鉴定正确。结论成功建立了XBP1s基因的Rosa26定点敲入F1代杂合子小鼠,为未来获得免疫细胞、肾脏固有细胞及腹膜间皮细胞XBP1s条件性敲入小鼠奠定了基础。

过表达蛋白合成与分泌相关蛋白提高CHO细胞anti- hLAG3产量

对比研究了过表达蛋白合成与分泌途径中的20种蛋白对瞬时表达细胞(ExpiCHO-S细胞)表达anti-hLAG3产量的影响,考察了转录因子XBP1s对ExpiCHO-S细胞生长、抗体产量和抗体亲和力的影响。结果表明,当所研究蛋白的表达质粒与anti-hLAG3质粒以1∶4的质量比共转染时, XBP1s能够使抗体产量提高约30%, GADD34、NFKBIz、CERT、C/EBPα和mTOR的过表达则会明显降低抗体产量,其他14种蛋白对抗体产量的影响较小。随着XBP1s共转染比例的增加,其对anti-hLAG3生产的促进作用增强,当共转染比例提高到60%时,相对于共转染比例为60%的EGFP,可使转染后168 h的抗体产量提高到2.1倍。此外,XBP1s的过表达对活细胞密度和细胞活率以及抗体亲和力的影响均较小。以上结果表明XBP1s可作为细胞工程的一个有效靶标用于提高CHO细胞重组蛋白的生产性能。