JAK/STAT信号转导途径活化和Mcl-1表达上调介导IL-6在人骨髓瘤细胞系XG-7上的凋亡抑制效应(英文)

背景和目的:IL-6能够抑制多种因素诱发的骨髓瘤细胞凋亡反应,在此过程中涉及到胞浆内一系列信号蛋白分子的参与。本研究旨在确定能够介导IL-6在人骨髓瘤细胞系XG-7上凋亡抑制效应的Bcl-2家族抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bcl-xL,Mcl-1)和IL-6信号转导途径(JAK/STAT、Ras/MAPK、PI-3K/Akt途径)。方法:采用碘化丙腚(PI)染色和流式细胞术分析XG-7细胞的凋亡情况;采用免疫印迹方法检测Bcl-2家族分子在XG-7细胞中的表达情况;分别采用针对JAK/STAT、Ras/MAPK和PI-3K/Akt途径的特异性抑制剂AG490、PD98059和LY294002处理XG-7细胞,从而确定哪条信号转导途径能够介导IL-6在XG-7细胞上的凋亡抑制效应。结果:IL-6能够抑制XG-7细胞凋亡,同时上调Bcl-2家族抗凋亡蛋白Mcl-1表达。AG490处理的XG-7细胞中Mcl-1表达上调被明显抑制;但PD98059和LY294002处理后对Mcl-1表达没有显著影响。结论:IL-6在XG-7细胞上的凋亡抑制效应是通过上调Mcl-1表达和激活JAK/STAT途径而介导的,与Ras/MAPK和PI-3K/Akt途径的活化状态无关。

转B7-1基因的人多发性骨髓瘤细胞XG-7在激发杀肿瘤细胞CTL中的作用

为调查B7－1分子在人多发性骨髓瘤细胞的表达是否可诱导出具有抗肿瘤作用的CD8+的CTL，我们用含B7－1基因逆转录病毒载体PTG5192的包装细胞293E的培养上清，感染人多发性骨髓瘤细胞系XG－7（不表达B7－1分子），用新霉素G418选择并经流式细胞仪筛选，获得了稳定高表达B7－1分子的XG－7细胞（命名为XG－7－B7细胞）。在体外增殖实验中，XG－7－B7细胞显示出比母系细胞XG-7对外周血淋巴细胞（PBL）具有更大的刺激活性。表型分析证实XG-7-B7细胞所刺激的PBL是一群T细胞，其表型特征为CD3，CD8阳性，CD25、CD28也高表达，而CD4和CD16几乎不表达。这群细胞可在体外长期培养扩增，并可用作效应细胞。细胞毒实验结果表明：CD8+T细胞可杀死XG－7－B7细胞、母系细胞XG－7和其它肿瘤细胞如K562与Daudi细胞。结果提示，这群肿瘤持异的CD8+CTL细胞对肿瘤的过继免疫治疗具有潜在的应用价值。

过表达MEG3慢病毒载体构建及其对骨髓瘤细胞系XG-7凋亡的影响

目的：构建过表达母系表达印记基因MEG3（materally expressed gene 3,MEG3）全长的慢病毒载体,观察其对骨髓瘤细胞凋亡的影响。方法：以包含MEG3全长的包装质粒pcDNA3.0-MEG3为模板,设计针对MEG3全长的引物（寡核苷酸片段）,经PCR扩增后获得MEG3全长,并将其亚克隆入线性化的慢病毒表达载体pCDH-EF1-copGFP中,经双酶切、PCR及测序等方法鉴定。利用脂质体转染试剂将鉴定正确的pCDH-EF1-MEG3-copGFP重组质粒转染HEK-293T细胞,进一步通过荧光显微镜和流式细胞术检测GFP表达效率,real-time PCR检测MEG3mRNA表达水平。通过三质粒共转染及PEG纯化的方法获得慢病毒,以优化感染滴度感染骨髓瘤细胞系,通过流式细胞术检测过表达MEG3对细胞凋亡的影响。结果：经酶切、PCR及测序等方法证实成功构建pCDH-EF1-MEG3-copGFP过表达载体;通过流式细胞术测定制备的慢病毒滴度为1.86×10^8pfu/ml;流式细胞术检测和realtime PCR方法证实MEG3在293T细胞和骨髓瘤细胞中表达明显上调;流式细胞术检测证实过表达MEG3可诱导骨髓瘤细胞凋亡。结论：成功构建并制备过表达MEG3的慢病毒过表达载体pCDH-EF1-MEG3-copGFP,该载体能高效过表达MEG3并诱导骨髓瘤细胞凋亡,进一步证实了MEG3具有抑癌功能,为进一步研究MEG3调控骨髓瘤细胞生物学特性及机制奠定了基础。

多发性骨髓瘤细胞XG-7诱导CD8和TCRαβ阳性的T细胞增殖分化成为细胞毒效应细胞

采用经密度梯度离心获得的正常健康人外周血淋巴细胞 (PBL )与多发性骨髓瘤细胞XG 7进行混合肿瘤淋巴细胞培养。3 H TdR掺入实验证实XG 7细胞可刺激PBL增殖 ;间接免疫荧光检测显示增殖的PBL中 ,CD4+ /CD8+ 细胞比例偏移 ,CD8+ T细胞增加。激活的CD8+ T细胞在含IL 2的培养体系中得到迅速扩增 ,占细胞总数的 96 %以上。流式细胞仪检测显示 ,扩增的T细胞表达CD3,CD8和TCRαβ ,而不表达CD4,CD16和CD5 6。细胞毒实验结果表明 ,扩增的CD8+ T细胞不仅杀伤原刺激细胞XG 7,也可杀伤其它肿瘤细胞如RPMI82 2 6 ,U2 6 6和Daudi。上述结果说明了经XG 7细胞所刺激PBL中的CD8+ T细胞可增殖分化成为抗肿瘤细胞的细胞毒效应细胞 ,这使得它们有可能在临床上用于肿瘤病人的治疗。

硫酸长春地辛对B细胞免疫抑制作用的体外实验研究

目的研究硫酸长春地辛对B淋巴细胞增殖及免疫功能的抑制作用。方法用CCK-8法检测不同浓度硫酸长春地辛(0、1、10、100、200、400ng/ml)作用于体外培养的多发性骨髓瘤XG-7细胞24 h后细胞活力的变化;同时用ELISA法检测细胞培养上清IgG水平及人B细胞活化因子(BAFF)水平;检测不同浓度硫酸长春地辛作用24 h后细胞的存活度。结果 (1)硫酸长春地辛作用24 h后,对XG-7细胞增殖有抑制作用,细胞活力随药物浓度增加逐渐降低,药物浓度为100、200、400 ng/ml时对细胞活力抑制作用明显,与空白对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05);(2)当硫酸长春地辛浓度为100、200、400 ng/ml时细胞培养上清中IgG含量明显减少,与空白对照组相比差异有统计学意义(P均<0.05);(3)当硫酸长春地辛浓度为200、400 ng/ml时细胞培养上清中BAFF含量明显降低,与空白对照比较差异有统计学意义(P均<0.05);(4)不同浓度硫酸长春地辛对XG-7细胞的存活度均无明显影响(P均>0.05)。结论硫酸长春地辛能抑制XG-7细胞增殖,抑制其分泌IgG及BAFF,可能为免疫性疾病治疗提供一种新的途径。