数字PCR技术的发展和应用

数字PCR(digital PCR,dPCR)技术作为一种全新的核酸检测方法,通过把反应体系均分到大量反应单元中独立地进行PCR,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸数量。目前dPCR主要分为微滴式和芯片式两种。与传统PCR技术相比,dPCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点。因此,dPCR技术在近年来得到了迅速的发展,广泛地应用于稀有突变检测、拷贝数变异分析和复杂样本基因表达检测等方面。

疟疾双重PCR检测方法的建立和初步应用研究

目的建立一种适合于我国恶性疟、间日疟和两者混合感染地区,一次性检测人体内或蚊体内的恶性疟原虫(P.f.)和间日疟原虫(P.v.)的双重聚合酶链反应(PCR)法.方法根据疟原虫红内期SSUrRNA基因特定片段,设计合成3条寡核苷酸特异引物,在一个反应体系中,同时检测P.f.与P.v.的双重PCR技术,操作方法按PCR常规.结果从P.f.和P.v.感染血样中,分别扩增出274bp和412bp的特异片段,检出水平达1～5个虫/μl血,而人基因组DNA、约氏疟原虫、伯氏疟原虫均未见扩增条带;但食蟹猴疟原虫(P.c.)与P.v.相似,在412bp可见扩增条带.经对采自不同疟区发热待查病人的滤纸干血滴和确诊疟疾病人的静脉血检测,344例血样中,检出阴性112例、P.f.109例、P.v.114例、P.f.+P.v.9例,阳性率67.4%;比常规镜检的阳性率66.3%稍高,尤以检出P.f.+P.v.感染病例高.分别检测人工感染P.f.与P.v.各10只大劣按蚊的阳性唾腺,均被检出同种的阳性结果.结论一次性检测P.f.DNA与P.v.DNA的双重PCR法,敏感性高,特异性强,稳定性好,具有简化操作、提高工效、降低耗费的优点.对发热待查病人诊断和蚊媒感染疟原虫调查,以及疟疾病原学的检测质控方面,均有实用价值.

运用双重PCR和ELISA法对云南部分地区PRRSV和PRV的检测分析

为了解云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的流行情况,试验采集云南省不同地区具有呼吸道症状的猪血清样品174份,首先建立PRRSV-GP基因和PRV-gB基因的双重PCR检测方法,然后运用建立的双重PCR方法和ELISA抗体检测试剂盒对PRRSV-GP和PRV-gB的阳性率及抗体水平进行检测分析。结果表明:试验建立了最低检测限度分别为1.48 ng/μL和0.67 ng/μL的PRRSV-GP和PRV-gB的双重PCR检测方法;单一PCR和双重PCR检测的PRRSV-GP阳性率为45.4%(79/174),PRV-gB阳性率为75.86%(132/174),混合检出率为5.17%(9/179);ELISA检测试剂盒检测的gE阳性率为0(0/174),PRRSV和PRV-gB的阳性率结果与单一PCR、双重PCR检测结果一致。说明试验构建的双重PCR方法有良好的敏感性和特异性;云南省部分地区PRRSV抗体阳性率低且免疫效果较差,PRV抗体阳性率相对较高且免疫效果良好。

转基因作物及产品检测技术研究进展

随着转基因技术的迅猛发展,转基因作物及其产品的安全性问题受到广泛关注,世界各国纷纷加大了对转基因生物及其产品的管理力度。转基因检测是转基因安全管理的技术保障,本文就国内外转基因作物及产品的检测技术进行了综述,重点介绍了目前使用较广泛的PCR、ELISA等转基因检测技术的原理和特点,提出了今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。

四种黄单胞菌的基因芯片检测方法的建立

结合双重PCR和基因芯片技术同时检测和鉴定我国检疫性细菌,包括水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)、水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola,Xooc)、柑桔溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri,Xac)以及严重危害十字花科作物的甘蓝黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)。以铁载体受体(Putative siderophore receptor)基因序列和RNA多聚酶西格玛因子(RNA polymerase sigma factor,rpoD)基因序列为靶标,设计引物和特异性探针能够同时检测这4种重要的病原菌。对17个细菌菌株进行芯片检测,仅4种靶标菌得到阳性结果,证明此方法具有很高的特异性。4种致病菌基因组DNA的检测灵敏度约为3 pg。检测结果表明,建立的基因芯片检测方法特异性强,能实现上述4种黄单胞菌的准确检测和鉴定,具有良好的应用前景。

猪伪狂犬病病毒检测方法研究进展

随着免疫学与分子生物学技术日臻完善,针对猪伪狂犬病的血清学方法和分子生物学检测方法不断改进。论文就近年来针对猪伪狂犬病病毒的中和试验、酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、胶体金免疫层析、核酸探针、基因芯片、多重PCR、LAMP等检测方法研究概况做一综述,为寻找合适的快速准确的检测方法、制定合理的免疫程序和发展新型的检测方法提供参考。

食源性致病菌多重分子生物学检测技术研究进展

快速、可靠的食源性致病菌高通量检测方法对于确保食品安全具有重要意义,近年基于DNA水平的多重分子生物学检测技术迅速发展,针对各种不同的食源性致病菌建立了多种多重分子检测技术,包括多重PCR、多重实时荧光PCR以及基因芯片等。对这些多重分子检测技术的最新研究进展作一综述,并且建议在今后该技术的研究中,仍需要在食品中多种致病菌同时选择性增菌培养、亚致死损伤修复以及检测内标的构建等方面取得突破,从而能够更好地实现食源性致病菌的高通量检测。

微生物的分子生物学检测技术进展

从PCR技术到生物芯片技术系统地综述了微生物的各种分子生物学检则方法,并对各种方法的特点进行了探讨。

Luminal B型局部晚期乳腺癌新辅助化疗疗效预测基因的研究

目的筛选Luminal B型局部晚期乳腺癌新辅助化疗疗效预测基因。方法收集10例Luminal B型乳腺癌患者,均行DA方案新辅助化疗(多西他赛75mg/m2静滴,d1;表阿霉素80mg/m2静滴d1,21天为1周期,共4个周期),根据化疗疗效分为完全病理缓解(pCR)组(n=3)和非完全病理缓解(npCR)组(n=7)。采用人基因表达谱cDNA芯片从10例乳腺癌患者中筛选新辅助化疗疗效相关基因,荧光定量PCR验证差异表达基因。结果 pCR组与npCR组癌组织相比,上调基因231个,下调基因195个;pCR组癌组织与癌旁组织相比,上调的基因357个,下调的基因544个;npCR组癌组织与癌旁组织相比,上调基因143个,下调基因101个;pCR组与npCR组癌旁组织比较,上调基因98个,下调基因67个。pCR组与npCR组癌组织比较,筛选出6个与肿瘤有关的基因,其中上调基因为CYP4Z1、FGFL6、BCAR4,下调基因为FABP4、S100B、ALPH1L1。荧光定量PCR进一步验证显示,两组mRNA表达差异的基因为CYP4Z1和BCAR4,pCR组两种基因表达均显著低于npCR组(P<0.05)。结论对局部晚期Luminal B型乳腺癌低表达BCAR4和CYP4Z1的患者新辅助治疗选择采用DA方案化疗更有可能获得pCR。

分子生物学方法在食品安全检测中的应用

综述了食品中病原微生物的快速检测方法,详述了PCR技术和基因芯片这两种技术的研究进展,并对这两种方法特点与应用进行了探讨。

基于基因芯片技术检测6种动物源性成分

[目的]建立一种运用PCR结合基因芯片技术鉴别牛、羊、猪、马、鹿、兔6种动物源性成分的快速、准确、灵敏的方法。[方法]选择线粒体DNA(mitochondrial DNA)基因(mt DNA)和细胞色素b(cytochrome b)基因(cytb)为目标基因,设计6对物种特异性引物和相应的6条鉴别探针,在此基础上建立了同时检测6种动物源性成分的基因芯片方法,并进行实际应用效果评价。[结果]通过对PCR扩增体系及杂交体系的优化,该检测方法能实现对上述6种动物源性成分同时进行快速、准确检测,具有良好的特异性,检测牛肉和马肉成分时绝对灵敏度为0.5 pg,实际检测灵敏度也可达到0.001%;所制备的基因芯片可以满足市售肉及肉制品样品的检测需求。[结论]本试验所建立的基因芯片方法特异性好、灵敏度高,可用于对生、熟肉制品中多种动物源性成分的检测和鉴别。

某市2109例女性宫颈细胞中HPV基因型别的研究

目的人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要致病原因。本文旨在探讨深圳市女性宫颈细胞中23种HPV感染的基因型分布情况。方法从深圳市妇幼保健院体检中心的2109例女性宫颈上皮细胞标本中提取23种HPVDNA,采用基因扩增及基因芯片技术对其宫颈细胞中的23种HPV基因型别进行检测,并对受检者的感染情况进行分析。结果 2109例女性宫颈上皮细胞标本中检出HPV感染者446例,总的HPV感染率为21.15%(446/2109),其中单一型别的阳性检出率为15.32%(323/2109);单一型别的感染中HPV52型为47例,其阳性检出率为2.23%(47/2109),其次是HPV43和58型均为38例,其阳性检出率均为1.80%(38/2109),是单一型别感染中最主要的型别。混合型HPV感染123例,其阳性检出率为5.83%(123/2109);其中HPV16+43、HPV16+58型各5例,均占混合型感染的4.07%(5/123),其次是HPV43+52、HPV43+56、HPV43+66型的二重感染各3例,均占混合型感染的2.44%(3/123),是混合型感染的主要型别。结论 HPV43、HPV52、HPV58单一型别及HPV16+43和HPV16+58型是感染深圳市女性宫颈细胞的主要基因型别,基因芯片检测技术可应用于宫颈细胞标本,一次可检测23种HPV基因型别,特异性强,敏感性高,对中国女性宫颈HPV感染基因型的分子流行病学的调查研究具有重要的意义。

10种猪常见病毒基因芯片检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种可同步检测猪10种常见疫病病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)、猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)和口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus,FMDV)的基因芯片检测技术,为临床病料的初步诊断及流行病学调查提供一个新的可靠方法。对10种病毒基因的序列进行分析,设计引物对靶基因进行PCR扩增,将纯化后的靶基因点制成芯片,通过Cy3标记特异性引物扩增病毒得到具有荧光标记的探针,然后与芯片进行杂交,扫描分析结果,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法和普通PCR/RT-PCR方法对1 006份样品进行符合检测。试验结果表明,基因芯片检测10种病毒特异性好、灵敏度高,最低检测限度可达10^(5 )copies·μL^(-1),检测中,基因芯片与普通PCR/RT-PCR对1 006份临床样品的检测符合率为96.79%以上。初步研究表明,该基因芯片技术可同时同步检测10种猪疫病病毒,可应用于临床病料的初步诊断。

分子生物学方法在食品微生物检测中的应用

近年来,食品安全受到广泛关注。及时、准确地检测出食品中的病原微生物是食品安全检测的重要内容,食品病原微生物的分子生物学检测技术因其特异性和灵敏性而备受瞩目。我们主要介绍了基因探针检测法、PCR检测法和基因芯片检测法的原理、开发及其在食品微生物检测中的应用。

基于双重芯片式数字PCR快速鉴定KPC型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的方法

【背景】由于碳青霉烯类药物的泛用和滥用,致使肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株与日俱增,产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。目前对肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株的检测方法存在费时费力、特异性差、灵敏度低等问题。【目的】建立一种能同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯酶基因blaKPC的双重芯片式数字PCR方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的特有基因yhaI和碳青霉烯耐药基因blaKPC保守序列设计特异性引物和探针,确定双重芯片式数字PCR同时对yhaI和blaKPC两个基因核酸浓度绝对定量的检测范围、检出限和最佳实验体系,并进行方法特异性、灵敏度、重复性分析及临床菌株的检测。【结果】双重芯片式数字PCR检测灵敏度比双重实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级,在两基因同时检出的情况下,最低检出限分别为3.74 copies/μL (yhaI基因)和1.93 copies/μL (blaKPC基因);优化后的双重芯片式数字PCR对参考菌株检测特异性的结果与双重实时荧光定量PCR结果一致;利用优化后的双重芯片式数字PCR方法共检测58株临床菌株,其中肺炎克雷伯菌43株,属肺炎克雷伯菌且含有blaKPC基因的菌株13株,这与质谱及耐药谱检测结果一致。【结论】利用双重芯片式数字PCR技术建立了产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的绝对定量检测方法。该方法特异性强、灵敏度高、准确度好,可用于检测具有碳青霉烯酶基因blaKPC的肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析,也为产其他类型碳青霉烯酶的病原菌检测提供了新的技术参考。

结核分枝杆菌耐药基因芯片检测在结核性脑膜炎中的应用

目的分析结核分枝杆菌耐药基因芯片检测在结核性脑膜炎应用中的价值。方法选取我院2015年9月—2017年9月诊治的结核性脑膜炎疑似病例136例为研究对象。采用随机数字表将其分为观察组和对照组,分别采用结核分枝杆菌耐药基因芯片法和酶联免疫吸附(ELISA)法对脑脊液进行检测,并根据检测结果进行诊断。并对诊断的准确率、检查时间等数据进行组间比较。结果观察组阳性率为18.6%,对照组阳性率为17.4%,观察组高于对照组(P>0.05);两组准确率分别为95.7%和85.5%,观察组高于对照组(P<0.05)。结论结核分枝杆菌耐药基因芯片检测在结核性脑膜炎应用中具有阳性率高,准确性高等优势。

普通PCR法、荧光定量PCR法及微流控芯片法检测大豆产品中外源基因灵敏度的比较

目的:为提高食品中转基因成分检测的灵敏度,将微流控芯片仪应用到转基因检测中。方法:将微流控芯片法与普通PCR法、荧光定量PCR法进行灵敏度比较;检测高温、高压处理过的转基因大豆粉。结果:荧光定量PCR法的灵敏度明显高于普通PCR法,但在较极端高温、高压处理(高压灭菌121℃/30 min)及转基因成分含量较低(1%)的情况下,采用荧光定量PCR法未能检测到外源基因,而微流控芯片法能检测到相应的峰值,前提是在未添加内标(Marker)的情况下。若添加内标,在内标峰和目的峰区分开的条件下,有损检测灵敏度。结论:微流控芯片在转基因检测中具有高效率、高灵敏度的特点,但该方法有待完善。

用于基因检测的微流控PCR荧光信号提取方法研究

针对微流控聚合酶链式反应(PCR)芯片荧光图像中反应腔识别与荧光信号提取的难题,提出了一种基于算法集成的微流控PCR芯片荧光信号提取方法。首先提取CCD图像中包含多个反应腔的目标区域,采用最小误差阈值分割法分离背景和反应腔,使用网格划分法提取单个反应腔区域,通过小波变换和改进的Canny算子相结合的方法实现反应腔边缘识别。然后对每个反应腔的识别区域进行像素灰度值求和,计算均值来表征本次循环荧光信号的强度。以人工质粒PUC-18基因为检测对象,开展了反应条件相同的四腔微流控实时荧光PCR实验。结果表明,本文方法可快速有效识别PCR反应腔并实时提取每个反应腔的荧光信号,绘制的扩增曲线一致性好,避免了亮、暗斑的影响,提高了基因扩增分析的准确性。

杧果露水斑病菌和细菌性黑斑病菌双重PCR体系的建立

杧果露水斑病和细菌性黑斑病在国内杧果产区普遍发生,严重威胁杧果安全生产,俗称杧果"两病"。建立准确高效的检测方法,提早检出杧果两病并及时采取防治措施,可有效减轻为害。本实验通过筛选反应体系和电泳条件,建立了可同时检测杧果中的露水斑病菌和细菌性黑斑病菌的双重PCR检测体系。结果表明:25μL反应体系,2×Taq PCR MasterMix 12.5μL,引物ML-SF9/SR5 (10μmol/L)各1.5μL、XcmHF/HR(10μmol/L)各1μL,模板各1μL,加ddH2O补足至25μL。反应条件为94℃预变性4 min;94℃变性45 s,65℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸5 min。电泳检测条件为1.5%琼脂糖凝胶浓度、120 V电压电泳25 min。该体系检测下限为杧果露水斑病原菌g DNA 0.224 ng/μL、细菌性黑斑菌液2.6×1~04cfu/m L。该技术可应用于田间杧果"两病"的早期检测与鉴定工作中。

诺如病毒检测方法研究进展

诺如病毒是引起人类非细菌性胃肠炎的主要病原之一,具有很高的传染性和变异性,可导致严重的公共卫生问题,尤其在抵抗力弱的人群中有很高的发病率,因此开发快速、准确的检测技术对预防和控制诺如病毒的传播是非常重要的。本文综述了近年来RT-PCR、环介导等温扩增、实时荧光定量PCR、巢式PCR、ELISA、免疫层析、基因芯片等技术在诺如病毒检测中的应用及发展趋势。