野油菜黄单胞菌8004菌株hrp基因簇侧翼序列大片段缺失突变体的构建及表型分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X anthom onas camp estris pv.camp estris,简称X cc),是一类能在全球范围引起十字花科植物黑腐病的γ-变形菌纲细菌。该菌有一个长41.7 kb的H rp致病岛,包含41个开放阅读框(ORF)。H rp致病岛5′端边界为IS1479插入元件,3′端边界为IS1595插入元件。G+C含量为62.3%,明显低于全基因组64.9%的G+C含量。根据基因类型,将该致病岛分为三个区段:位于致病岛中心区的hrp基因簇、及其左侧翼的假定基因区段(HGR)和右侧翼的降解酶类基因区段(EGR)。HGR长7.4 kb,注释蛋白编码基因6个,全部为功能未知的假定基因。EGR长9.3 kb,注释蛋白编码基因8个,其中6个为降解酶类基因。为了鉴定hrp基因簇侧翼序列的功能,采用标记置换的突变方法,将X cc 8004的hrp基因簇右侧翼EGR片段缺失。该突变体8004ΔR对寄主植物的致病力比野生型菌株显著降低,而在非寄主植物辣椒ECW-10R上仍能引起过敏反应。该突变体其它的致病相关生化因子,如胞外多糖产量和胞外酶的活力均未受明显影响。实验结果表明EGR区段的缺失不影响三型分泌系统的正常功能,也不影响该菌在基本培养基上的生长,但使X cc的致病力明显降低,提示X cc 8004菌株hrp基因簇右侧翼序列中存在与致病相关的基因。

十字花科黑腐病菌hrp基因致病功能分析

通过对Xcc 8004菌株的hrp基因进行逐一敲除,系统研究单个hrp基因对Xcc致病性的贡献。结果表明,9个hrc(hypersensitive response and conserved)基因单独突变后在满身红萝卜上的致病性和在辣椒ECW-10R上激发HR的能力完全丧失;9个hrp基因中,hrpW突变后在辣椒ECW-10R上仍能产生HR,满身红萝卜上致病性减弱,其余hrp基因突变后致病性和过敏反应均丧失;4个hpa(hrp associated protein)基因突变后,hpaA和hpaB突变体完全丧失在满身红萝卜上的毒性也不能在辣椒ECW-10R上引起HR,hpa1和hpaP突变后致病性和HR显著减弱。另外,通过RT-PCR对Xcc 8004 hrp基因簇的每个基因受hrpX和hrpG的调控情况进行分析,结果表明所有hrp基因在不同程度上都受到hrpG、hrpX的正向调控。