采用两种突变方法对甘蓝黑腐病菌XC_1348基因的功能解析

为研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004基因组中一个功能未知的假定蛋白XC_1348的基因功能,本研究用自杀质粒pK18mob和pK18mobSacB分别通过同源单交换和同源双交换构建XC_1348的非极性整合突变体1348nk和有标记的缺失突变体DM1348Gm,并对两种突变体的表型进行检测,结果显示该基因突变后不影响细菌的胞外多糖(EPS)产量、胞外酶活性以及细菌游动性。有趣的是该基因的两种突变体的致病力存在较大差异,原因可能是Xcc经两种方法定点突变后分别具有的不同基因组结构而影响到某些基因的表达所致。通过研究初步了解了XC_1348基因的功能并为今后改进定点突变方法提供现实依据。

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明,XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374病斑平均长度分别为13.000和11.983mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。

野油菜黄单胞菌的HpaA基因功能

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.Campestris,Xcc)是使十字花科植物产生黑腐病的重要病原细菌。Xcc通过Ⅲ型分泌系统分泌效应蛋白到植物体内帮助Xcc的侵染和繁殖。Hpa A蛋白是一个广泛存在于黄单胞菌中的效应蛋白,在辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria,Xcv)中,Hpa AXcv85-10已经被证明是一个Ⅲ型效应蛋白,并且参与其他效应蛋白的分泌过程,但是在Xcc中,对Hpa A的功能还不是了解得很清楚。本研究以Xcc8004菌株的Hpa A蛋白为研究对象,通过分泌蛋白检测和亚细胞定位分别研究Hpa AXcc8004是否也由Ⅲ型分泌系统分泌以及Hpa AXcc8004在植物细胞的作用部位。结果表明,Hpa AXcc8004的分泌依赖于Xcc8004的Ⅲ型结构基因hrc V,暗示着Hpa AXcc8004也是作为Ⅲ型分泌效应蛋白来发挥功能。在拟南芥原生质体细胞中,将Hpa AXcc8004与GFP蛋白融合表达,发现Hpa AXcc8004定位于植物细胞核中。进一步通过同源重组的方法获得了Xcc8004 Hpa A基因缺失突变体,在寄主甘蓝、萝卜、拟南芥上分别接种野生型Xcc8004和Hpa A基因缺失突变体,发现基因缺失突变体毒性显著降低,表明Hpa AXcc8004在上述寄主植物上对于Xcc8004的完整毒性是必须的。在Hpa A的拟南芥转基因植株上,Hpa AXcc8004还可以减弱假单胞菌DC3000和Xcc8004发黄的表型。

野油菜黄单胞菌的XopR基因功能

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种能够引起十字花科植物产生黑腐病的重要病原菌。笔者以野油菜黄单胞菌Xcc8004菌株XopR基因为研究对象,通过qRTPCR发现,XopR基因的表达受Ⅲ型调控基因hrpG和hrpX的调控,并且XopR蛋白的分泌依赖于Ⅲ型分泌系统结构基因hrcV,这表明XopR是Xcc8004的一个Ⅲ型分泌效应蛋白。利用同源重组的方法,笔者获得了XopR基因的缺失突变体ΔXopR。将野生型Xcc8004和ΔXopR突变体分别接种甘蓝品种中甘15、中甘21和大白菜品种中白83,发现ΔXopR突变体菌株致病性下降,表明XopR对于Xcc8004在甘蓝上的完整毒性是必须的。GFP融合蛋白分析发现XopR定位于拟南芥原生质体的细胞膜上,可以在拟南芥原生质体中抑制细菌鞭毛蛋白诱导的FRK1基因表达。