嗜线虫致病杆菌CB6菌株胞内外杀虫蛋白的纯化及比较研究

【目的】分离和纯化嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophila var.pekingensis)CB6菌株胞内和胞外杀虫蛋白,鉴定其蛋白种类。为进一步利用此类杀虫蛋白奠定基础。【方法】采用硫酸铵沉淀、DEAESepharoseFF离子交换柱层析、Butyl SepharoseFF疏水柱层析和SephacrylS-200HR凝胶过滤对该类蛋白进行分离和纯化,采用Native-PAGE和SDS-PAGE技术对所纯化蛋白进行组分分析。【结果】获得达电泳纯的胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2。以2.58μg·ml-1含量E1、以4.21μg·ml-1含量E2喂饲棉铃虫初孵幼虫,对幼虫的生长抑制率分别达62.63%和97.9%。E1、E2经相同纯化参数处理获得的洗脱图相似,经native-PAGE和SDS-PAGE呈现出相似的单带电泳图谱。SDS-PAGE测得E1、E2表观分子量大于212kD,该杀虫蛋白在60℃仍表现出较强的活性。电泳染色结果表明该类蛋白非糖蛋白也非酯蛋白。【结论】CB6菌株胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2可能是同一种(类)蛋白。

高毒力杀虫细菌嗜线虫致病杆菌CB6菌株的培养基优化

用正交试验法研究了嗜线虫致病杆菌北京变种菌株CB6的营养利用以及培养基成分的改变对产生杀虫活性物质的影响。通过筛选该菌对碳源、氮源以及无机盐的需求,确定了该菌的最佳发酵培养基为(g/L):豆粉40g,蔗糖15g,蛋白胨15g,酵母膏10g,玉米浆5g,NaH2PO41g,NaCl5g,谷氨酸5g。培养液上清液对玉米螟初孵幼虫的体重抑制率为90 81%,比基础培养基的杀虫活性提高了46.5%。

嗜线虫致病杆菌北京变种质粒形态的研究

嗜线虫致病杆菌是小卷蛾斯氏线虫体内的共生细菌,在实验室条件下延长培养将会出现型态变异,即从野生型的Ⅰ型细胞变为Ⅱ型细胞。本文以嗜线虫致病杆菌北京变种Ⅰ、Ⅱ型菌株为材料,对其质粒形态进行了研究。运用碱裂解法提取质粒,电泳结果发现Ⅰ型菌带型单一,只有一条,分子量大于23kb,命名为pBJ-1。而Ⅱ型菌株除了含有大于23kb的条带外,还有另一条带出现在6kb的位置上,分别命名为pBJ-2和pBJ-3。限制性内切酶处理后,两菌株质粒得到的消化产物有所不同,即嗜线虫致病杆菌北京变种Ⅰ型、Ⅱ型菌株之间的质粒存在差异。本试验还尝试将质粒pBJ-1和pBJ-2分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,并证明这两种质粒上可能含有氨苄青霉素抗性基因和链霉素抗性基因。

嗜线虫致病杆菌北京变种的抗生素抗性及质粒pLA2917的转化

用最小抑制浓度法对嗜线虫致病杆菌北京变种野生型菌株的抗生素抗性进行了测定。结果表明,该菌株对氯霉素、新霉素和卡那霉素敏感,而对链霉素、氨苄青霉素和青霉素具有不同程度的抗性。利用滤膜三亲交配的接合转移方法,以嗜线虫致病杆菌北京变种作为受体细菌,在卡那霉素、四环素和氨苄青霉素的选择压力下,筛选得到接合转移子。经过菌落PCR鉴定,证明质粒pLA2917已经成功转移到嗜线虫致病杆菌北京变种细胞内。对昆虫病原线虫共生细菌的质粒转移方法进行了讨论。

嗜线虫致病杆菌北京变种的型变进程及抗生素相关性质的研究

嗜线虫致病杆菌是小卷蛾斯氏线虫体内的共生细菌,在实验室条件下延长培养将会出现型态变异,即从野生型的I型细胞变为II型细胞。对嗜线虫致病杆菌北京变种的型变进程进行了研究,结果发现,嗜线虫致病杆菌北京变种I型菌株在LB培养基中培养4 d即有II型菌出现;培养10 d后,II型菌的比例超过50%;培养到22 d时,II型菌在整个NBTA平板中的比例几乎达到95%。然后分别以I型菌株和II型菌株为材料,对其产素能力和抗生素抗性水平进行了比较,结果显示,北京变种II型菌株对枯草芽孢杆菌的抑制水平降低到I型菌的10.08%;2种型态的菌株均对青霉素和氨苄青霉素具有抗性,其中I型菌株的耐受程度高于II型菌株,因此,嗜线虫致病杆菌北京变种2型细胞的产抗生素能力差异与抗生素抗性水平差异之间可能存在相关性。