缺氧微环境下仙连解毒方通过调控HIF-1α影响结直肠癌细胞迁移的作用及机制研究

目的 通过体外实验研究缺氧微环境下仙连解毒方(Xian-Lian-Jie-Du-Formula,XLJDF)抑制结直肠癌细胞迁移的有效性及其潜在机制。方法 厌氧细胞培养箱(95%N2、5%CO_(2),O_(2)浓度<1%)中培养人结直肠癌细胞HCT-116,MTT比色法检测XLJDF对细胞活力的影响;伤口愈合实验和细胞迁移实验(Transwell法)检测XLJDF对细胞迁移能力的作用;取对数生长期的细胞分组进行转染和慢病毒感染,RTPCR检测HCT-116细胞中HIF-1α mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HCT-116细胞中HIF-1α、EMT相关蛋白的表达情况及XLJDF对TGF-β/smad信号通路的调控作用。结果 缺氧条件下,XLJDF能抑制HCT-116细胞活性(P<0.05或P<0.01)。细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验示,XLJDF干预后,与空白对照组相比,细胞迁移速率显著降低(P<0.05或P<0.01),传入下室的细胞数目显著减少(P<0.05或P<0.01);与空载体组对比,XLJDF能降低HIF-1α过表达细胞株的细胞迁移速率(P<0.05或P<0.01)和减少传入Transwell下室的细胞数(P<0.05或P<0.01)。Western blot法检测EMT、TGF-β/Smad通路相关蛋白表达,与常氧组相比,缺氧条件下细胞内HIF-1α蛋白表达水平显著升高,且在24 h内呈时间依赖性;XLJDF各浓度干预组,E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达水平显著上升,N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、TGF-β1、p-Smad3的表达量均降低(P<0.05或P<0.01)。结论 缺氧微环境下仙连解毒方能减弱结直肠癌细胞HCT-116迁移能力,调控HIF-1α介导的TGF-β/smad信号通路激活、逆转EMT可能是其潜在机制之一。

基于单细胞转录组测序探讨仙连解毒方对结直肠癌湿热瘀毒证模型小鼠肠道免疫细胞的影响

目的探讨仙连解毒方治疗结直肠癌湿热瘀毒证的可能作用机制。方法30只C57BL/6N小鼠随机分为正常组、模型组、仙连解毒方组,每组10只。模型组和仙连解毒方组小鼠采用高温高湿环境、高脂饮食与氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠联合诱导建立结直肠癌湿热瘀毒证小鼠模型。造模成功后,仙连解毒方组给予仙连解毒方12.9 g/(kg·d)灌胃,正常组、模型组给予0.2 ml生理盐水灌胃,均每周6次,连续16周。给药期间每周统计疾病活动指数(DAI)评分,末次给药后处死小鼠,检测小鼠血清二胺氧化酶(DAO)、结直肠组织髓过氧化物酶(MPO)含量,取结肠组织进行单细胞转录组测序(scRNA-seq),采用SingleRv1.4.1,根据细胞表面标记基因,对肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞进行细胞亚型鉴定,分析各组小鼠免疫细胞表达的差异基因的生物学功能和信号通路。结果仙连解毒方组给药第7周至第16周,DAI评分较模型组显著降低(P<0.01)。与正常组比较,模型组小鼠生存率显著降低,血清DAO、结直肠组织MPO水平显著升高(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,仙连解毒方组小鼠生存率升高,血清DAO、结直肠组织MPO水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。scRNA-seq分析结果显示,小鼠肠道T细胞可分为CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞、自然杀伤(NK)T细胞、γδT细胞4种亚型。与模型组比较,仙连解毒方组小鼠肠道组织中肠上皮细胞、成纤维细胞、红系细胞数量和占比升高,B细胞、T细胞、髓系细胞数量和占比降低;T细胞中激活CD4^(+)T细胞,效应CD4^(+)T细胞、记忆CD8^(+)T细胞、CD4^(+)T细胞、γδT细胞、NK T细胞数量和占比降低,细胞毒性CD8^(+)T细胞、耗竭CD8^(+)T细胞数量和占比升高,CD8^(+)T细胞、初始CD4^(+)T细胞、记忆CD4^(+)T细胞、调节性T细胞(Treg)、初始CD8^(+)T细胞数量降低,占比升高;髓系细胞中各类细胞数量皆下降,其中巨噬细胞与中性粒细胞占比降低,肥大细胞、树突状细胞占比升高。差异基因富集分析显示,仙连解毒方对CD8^(+)T细胞的调控功能主要富集在RNA聚合酶Ⅱ对转录的正向调控、转录因子激活蛋白-1(AP-1)复合物等,信号通路主要富集在破骨细胞分化、白细胞介素(IL-17)信号通路、核因子κB(NF-κB)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等方面;对CD4^(+)T细胞的调控功能主要富集在伴侣辅因子依赖性蛋白质重折叠、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)级联负调控等,信号通路主要富集在炎症性肠病、破骨细胞分化、细胞凋亡、TNF信号通路等方面;对髓系细胞的调控功能主要富集在炎症反应、中性粒细胞趋化性、免疫反应等,信号通路主要富集在IL-17信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路、抗原提呈加工等方面。结论仙连解毒方可能通过调控TME中的CD8^(+)T细胞、CD4^(+)T细胞、γδT细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等多种免疫细胞数量和比例,干预Th1/Th2细胞分化、Th17细胞分化、IL-17、TNF、NF-κB等信号通路,改善结直肠癌免疫、炎性微环境,从而治疗结直肠癌湿热瘀毒证。

仙连解毒方对结直肠癌湿热瘀毒证模型小鼠肠道细胞类型的影响

目的采用单细胞转录组测序技术探讨仙连解毒方治疗结直肠癌湿热瘀毒证的作用机制。方法30只雄性C57BL/6N小鼠随机分为对照组、模型组、仙连解毒方组,每组10只。模型组和仙连解毒方组小鼠采用高脂饮食与氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导建立结直肠癌湿热瘀毒证模型,对照组给予正常饮食。3个循环的DSS饮水结束后,仙连解毒方组开始给予仙连解毒方12.9 g/kg灌胃,对照组及模型组给予等体积的生理盐水,每天1次,连续灌胃6天后停1天,连续给药16周。末次给药结束4 h后,取各组小鼠结直肠组织,HE染色观察小鼠结直肠的组织病理形态。取距肛门6 cm的远端结肠段2 cm,解离组织样本,分离单细胞悬液,提取RNA行qPCR扩增,进行单细胞转录组测序。采用CellRanger-v5.0.0进行数据质控,Seurat-v3.1.1软件包进行降维聚类分析、细胞类型鉴定,对差异基因行GO和KEGG富集分析。结果HE染色结果显示,空白组小鼠结肠腺体排列规则,细胞核位于基底部,呈扁平或立方状;模型组上皮细胞极性消失,呈巢状、筛孔状,中央见坏死,细胞核浆比增大,核染色深,核仁明显,核分裂现象显著;仙连解毒方组上述情况得到明显改善。单细胞转录组测序共捕获3组小鼠肠道细胞45480个,降维聚类将所有细胞归为20个细胞群,鉴定各细胞群标记基因,分析得出小鼠肠道细胞主要包括9种细胞类型:肠上皮细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、天然淋巴细胞、干细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、成纤维细胞。仙连解毒方组较模型组小鼠肠道组织中肠上皮细胞占比上升,B细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞占比下降。GO与KEGG富集分析显示,仙连解毒方对结直肠癌湿热瘀毒证的作用主要富集在免疫系统进程、抗原处理和呈递、适应性免疫反应、转运ATP合酶活性旋转机制等方面,信号通路主要涉及免疫系统信号、癌症相关通路、细胞增殖与死亡信号、能量代谢信号等。结论仙连解毒方调控结直肠癌湿热瘀毒证模型小鼠肠道组织中免疫细胞比例,抑制上皮细胞间质转化,可能是其治疗结直肠癌湿热瘀毒证的作用机制。