新吉细毛羊和小尾寒羊差异表达miRNAs筛选与调控网络分析

【目的】筛选新吉细毛羊和小尾寒羊体内差异微小RNAs(microRNAs,miRNAs),研究miRNAs和靶基因对羊毛纤维机制表达的调控模式。【方法】选取两种毛细度存在显著差异的新吉细毛羊(XFWS)和小尾寒羊(SXW),采集血浆中外泌体进行转录组测序,构建文库并鉴定miRNAs,使用edgeR包对miRNAs进行差异表达分析,使用miRanda和Targetscan软件预测miRNAs的靶基因,对靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,对差异miRNAs靶基因进行miRNAs-mRNA互作调控网络分析,使用实时荧光定量PCR对转录组数据中miRNAs进行验证。【结果】新吉细毛羊和小尾寒羊血浆外泌体中存在1019个miRNAs,其中已知miRNAs 112个,新预测miRNAs 907个,经筛选存在差异表达miRNAs 364个,其中与羊毛细度呈正相关性基因62个,呈负相关性基因302个。经多数据库比对获得靶基因的注释信息18996个,GO功能富集分析显示,17193个注释靶基因富集到6608个条目中;KEGG通路分析显示其富集在276个通路之中,经蛋白互作分析找到与羊毛纤维机制表达相关miRNAs 5个及靶基因42个。实时荧光定量PCR验证差异miRNAs结果显示,oar-miR-218a、oar-miR-370-3p、oar-miR-133、oar-miR-29a、oar-miR-27a、oar-miR-485-3p、oar-miR-22-3p、oar-miR-23a、oar-miR-148a、oar-miR-412-3p在新吉细毛羊体内表达量均显著高于小尾寒羊(P<0.05),oar-miR-26a、oar-miR-29b、oar-miR-329b-3p、oar-miR-409-3p、oar-miR-30a-3p在小尾寒羊体内表达量均显著高于新吉细毛羊(P<0.05),与转录组测序结果一致。【结论】新吉细毛羊和小尾寒羊体内存在oar-miR-218a、oar-miR-370-3p、oar-miR-133等364个差异miRNAs,其中oar-miR-133、oar-miR-150、oar-miR-127、oar-miR-23a、oar-miR-370-3p与其42个靶基因共同参与羊毛纤维机制表达,FGFR2、NOTCH1、SHH参与多通路调节,在联级调节中起重要作用。

多功能复合菌剂发酵玉米秸秆对育肥羊能量代谢的影响

本文目的是研究多功能复合菌剂发酵玉米秸秆对育肥羊能量代谢的影响。选择18只体况良好、体重相近的新吉细毛羊作为试验动物,随机分为对照组、试验组和绝食代谢组,每组3个重复,每个重复2只。每期试验包括预试期10d、正试期3d,共测定3期。对照组的粗饲料是冷藏保鲜的玉米秸秆,试验组为50%发酵玉米秸秆+50%冷藏保鲜玉米秸秆,绝食代谢组的试羊正试期3d绝食。通过开放式呼吸测热装置进行消化代谢试验、气体交换试验和呼吸测热试验。结果显示:试验组消化能在第1期中极显著的高于对照组(P<0.01),第2、3期中显著高于对照组(P<0.05);试验组甲烷能及甲烷能/总能在3期中均显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01);3期产热量2组间无显著差异(P>0.05);3期试验组代谢能显著高于对照组(P<0.05);试验组总能消化率在第1、2、3期中比对照组分别提高10.33%、11.52%、11.86%,差异显著(P<0.05);试验组总能代谢率相比对照组在第1期提高11.18%,差异不显著(P>0.05),在第2、3期分别提高22.66%、17.19%,差异显著(P<0.05);试验组净能在第1、2、3期中比对照组分别提高64.29%、108.1%、84.90%,差异显著(P<0.05)。结果提示,发酵玉米秸秆相对于未经处理的玉米秸秆,营养物质的含量得到提高,品质得到改善。将其用于育肥羊粗饲料,可使育肥羊能量代谢水平提高,促进能量沉积与利用,提高净能。

绵羊血管内皮生长因子D基因克隆与表达分析

为了克隆小尾寒羊与新吉细毛羊血管内皮生长因子D(VEGF-D)基因,检测其多态性及组织表达分布规律,探讨两个品种绵羊毛用性状差异是否与该基因存在必然联系,试验提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,采用RT-PCR方法克隆VEGF-D基因并进行生物信息学分析,定量PCR方法分析两个品种间该基因的表达差异。结果表明:成功克隆出小尾寒羊与新吉细毛羊VEGF-D基因,该基因全长1 487 bp,含有完整的开放阅读框(ORF),长度为1 065 bp,编码354个氨基酸。绵羊VEGF-D基因无论在核苷酸还是氨基酸水平上与亲缘关系更近的牛具有较高同源性。小尾寒羊及新吉细毛羊品种间VEGF-D基因存在较多的多态位点,且相应突变位点均引起氨基酸的改变,提示该基因在品种间存在较大的选择压力,上述突变位点主要位于PDGF结构域两侧,提示其可能通过影响VEGF-D蛋白的水解过程来调控其功能。绵羊VEGF-D基因为各组织广泛表达基因,但其主要在肺脏与脾脏中高表达。不同季节绵羊皮肤组织VEGF-D基因表达模式不同,主要表现为寒冷季节高表达,而气温升高表达量逐渐降低。说明小尾寒羊与新吉细毛羊两个品种中VEGF-D基因存在较高的多态性,不同组织器官与不同季节皮肤组织表达分布相类似。

绵羊角蛋白关联蛋白8.2基因克隆与表达分析

本研究旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8.2(keratin-associated protein,KAP8.2)基因mRNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KAP8.2基因并进行两个品种间的比较分析,实时荧光定量PCR方法分析两个品种间KAP8.2基因的表达谱差异。结果表明已成功克隆出绵羊KAP8.2基因mRNA,该片段长574bp,其中ORF区192bp,编码63个氨基酸,甘氨酸(Gly)和酪氨酸(Tyr)含量依次为23.8%和20.6%,属于典型的HGT-KAP家族。多态性分析显示新吉细毛羊与小尾寒羊KAP8.2基因间存在丰富的多态性,多态位点多位于CDS区两侧,其中小尾寒羊KAP8.2基因3′UTR区c192+19-39出现一个疑似fru-let-7j的作用靶位。不同组织表达谱分析显示该基因为多组织表达基因,但两个品种羊不同组织表达谱存在较大差异,表现为小尾寒羊在脾脏、肝脏和皮肤中高表达,而新吉细毛羊则在皮肤和心脏中高表达。本研究提示小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8.2基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因与毛表型性状相关。

利用SMART技术构建新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA文库

【目的】探寻控制羊毛性状的相关基因,构建了新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA文库。【方法】采用Clontech公司的CreaterTM SMARTTM cDNA library construction kit,用Biozol试剂提取新吉细毛羊皮肤组织总RNA后,以反转录酶SuperscriptTMⅡ反转录为第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA,扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB（带有SfiⅠA和B 2个位点）质粒载体中,最后用热击转化法将重组质粒转化到E.coliDH5α内,得到新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA原始文库,扩增后的文库分装后用50 mL离心管保存。【结果】构建的cDNA文库约含4.2×105个独立克隆,重组效率为100%,插入片段多为0.5～3.0 kb,平均插入片段长度为1.3 kb,符合建库要求。【结论】经检测所构建的文库库容量满足基因筛选要求,可用于特异表达基因全长序列。

新吉细毛羊皮肤组织均一化全长cDNA文库的质量评价

通过对已构建新吉细毛羊皮肤组织的均一化全长cDNA文库进行活化，在此基础上进行EST生物信息学分析研究，期望能发现影响细毛羊羊毛性状的主效基因或相关基因。运用菌落PCR、菌液PCR、质粒快速鉴定3种方法对cDNA文库进行评价，通过测序，在NCBI上BLASTn搜索、比对及运用DNAstar等软件进行分析。初步鉴定的结果：cDNA文库的库容量（滴度）为1．57×10。pfu／mL，菌落PCR、菌液PCR阳性克隆的小片段率在80％～90％，克隆的片段大小在0．6～2．0kb，cDNA在300～500bp，而质粒快速鉴定的在90％，克隆的片段载体带大小3．5～5．0kb。质粒快速鉴定的效果好于其他两种方法，耗时相对短，同时小片段率高；cDNA文库保存完好，符合基因文库的质量要求，有足够大的库容量来保证筛选目的基因。通过对筛选的阳性克隆5’端随机测序，随后获得可读序列169条，经过相关生物信息查询之后，发现其中可能含有完整基因。

绵羊KAP8-1基因克隆与表达分析

本文旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8-1(KAP8-1)基因c DNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR法克隆KAP8-1基因,定量RT-PCR方法分析2个品种间KAP8-1基因的表达谱差异。结果表明:已成功克隆出绵羊KAP8-1基因,该基因片段长225 bp,其中ORF区189 bp,编码62个氨基酸,分析显示该KAP8-1基因属于典型的HGT KAP家族,甘氨酸和酪氨酸含量分别为22.6%和17.7%;小尾寒羊与新吉细毛羊间存在丰富的多态性,且多态位点均引起关键性氨基酸的突变;组织表达谱检测表明KAP8-1基因为多组织表达基因,小尾寒羊与新吉细毛羊中不同组织表达谱丰度存在显著差异,表现为小尾寒羊脾脏、肝脏中高表达,而新吉细毛羊则皮肤、心脏中高表达。结果显示,小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8-1基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因可能与毛表型性状密切相关。

绵羊皮肤组织VEGF-A基因可变剪切体存在的证实与鉴定

为了克隆绵羊血管内皮生长因子A(VEGF-A)基因,探寻该基因与绵羊毛囊发育及毛用性状形成的潜在关系,试验采用RT-PCR方法从小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织克隆出VEGF-A基因mRNA并对其进行生物信息学分析。结果表明:以皮肤组织cDNA为模板,RT-PCR扩增出3条特异性条带;克隆测序结果显示所有条带均为VEGF-A基因序列,片段长度依次为828,825,756,624bp。828bp和825bp片段属于全长VEGF-A,其中825bp片段在3′非编码区缺失3个碱基;756bp和624bp片段由可变剪切产生,分别为外显子6缺失和外显子6,7双缺失,编码蛋白与人类VEGF-A165和VEGF-A121类似;核苷酸序列比对发现,VEGF-A基因mRNA仅存在3个SNP位点;蛋白结构域分析发现,三种类型VEGF-A蛋白均含有完整的血小板衍生生长因子(PDGF)结构域。说明试验成功地从绵羊皮肤组织中克隆到VEGF-A基因并证实可变剪切突变体的存在。

新吉细毛羊KAP24.1基因多态性及羊毛性状的相关性分析

为了解角蛋白关联蛋白(KAP)24.1基因在新吉细毛羊群体中的多态性与其毛用性状的关联性,试验采用DNA测序法对新吉细毛羊基因组编码区进行测序,找出基因突变位点,然后采用PCRSSCP技术对497只新吉细毛羊KAP24.1基因编码区序列进行多态性分析,并利用最小二乘模型对其多态性与产毛量、纤维直径、拉伸长度进行关联性分析。结果表明:在编码区有两处突变点,一处在348 bp处发生C→T的突变,脯氨酸突变为亮氨酸;另一处在414 bp处发生T→C的突变,丝氨酸突变为脯氨酸,均属于错义突变,KAP24.1基因的AA、AB、BB和CC基因型与纤维直径不相关(P>0.05),BB基因型的产毛量和拉伸长度显著大于AB基因型、CC基因型(P<0.05)。说明KAP24.1基因可以作为新吉细毛羊产毛量和拉伸长度主要候选基因之一,BB基因型可以作为分子标记用于预测绵羊产毛量和拉伸长度。

绵羊胎盘生长因子基因可变剪切异构体克隆与表达分析

为克隆绵羊胎盘生长因子(Placental growth factor,PGF)基因,并分析该基因在绵羊组织器官中的表达模式,本研究首先利用RT-PCR(Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法从小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织克隆出PGF基因mRNA片段,随后利用可变剪切(alternative splicing,AS)鉴别引物和qRT-PCR(Quantity reverse transcript polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法对不同组织器官PGF基因AS及其表达模式进行分析.以两个品种绵羊皮肤组织cDNA为模板,RT-PCR扩增显示存在2条特异性扩增片段,克隆测序结果发现片段长度依次为1339bp和1276bp,分析发现1276bp片段是由于主转录本第7外显子缺失产生,为编码羧基末端缺失21个氨基酸的PGF蛋白突变体.该突变体并未引起血小板源生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)结构域改变,可能通过改变PDGF结构域下游单位酶切位点来影响PGF分子的成熟.PGF基因AS检测及qRT-PCR结果发现小尾寒羊与新吉细毛羊不同组织器官PGF基因可变剪切突变体组织分布及其表达模式存在明显差异.本研究证明绵羊皮肤组织中表达PGF基因且存在AS现象,为进一步研究PGF基因在绵羊毛囊发育及毛用性状形成中的作用奠定了基础.

新吉细毛羊级进杂交斯达夫细毛羊效果

以新吉细毛羊作父本、斯达夫洛普细毛羊作母本进行级进杂交,抽样测定级进各代羊生产性能结果表明,级进各代母羊细度逐代变细、净毛量逐代上升、毛长逐代增长、体重逐代下降,其中:成年母羊级进3代和育成母羊级进1代净毛量提高显著(p<0.05);育成母羊级进2、3代净毛量提高极显著(p<0.01)。

新吉细毛羊5个生殖激素受体基因多态性分析

本研究旨在检测新吉细毛羊促性腺激素释放激素(GnRHR)、促黄体素(LHR)、促卵泡素(FSHR)、催乳素受体(PRLR)、雌激素(ESR)5个生殖激素受体基因多态性,为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据。以119只新吉细毛羊个体为研究对象,利用ABI测序仪检测基因多态性;用DNASTAR软件与I-TASSER软件预测蛋白质三级结构;用Excel计算基因型频率;用GraphPad prism 6软件进行新吉细毛羊群体5个生殖激素受体基因多态性与产羔数的相关性分析。经测序分析发现,FSHR基因不存在突变位点,其余4个基因存在13个突变位点。GnRHR基因存在A505G、G720C突变,LHR基因存在T1262G、A1991G、C2012T、A2032T、T2041A的突变,PRLR基因存在A1263G、C1544G突变,ESR基因存在A106T、C181T、G612A、C735T突变。在新吉细毛羊群体4个基因多态性与产羔数相关性分析结果中,只有ESR基因A106T突变对新吉细毛羊产羔数影响显著。其中AA、AT、TT 3种基因型个体的平均产羔数分别为1.391、1.101、1.417。AA基因型、TT基因型平均产羔数比AT基因型分别多0.290、0.316个(P<0.05)。AA基因型、TT基因型平均产羔数之间差异不显著(P>0.05)。

新吉细毛羊羔羊0～60日龄生长规律研究

【目的】羔羊前60 d生长发育较快,研究0~60日龄新吉细毛羊生长发育规律,为生产中早期饲养提供理论依据。【方法】测定新疆塔城种羊场613只新吉细毛羊羔羊初生、10、20、30、40、50和60日龄的体重,分析不同日龄段羔羊的生长发育规律及不同群别对羔羊生长的影响。【结果】新吉细毛羔羊的日增重和相对生长速度0~10日龄最快,20~50日龄下降,50~60日龄大幅下降,可将新吉细毛羔羊的生长分为3个阶段,分别为0~10日、20~50日龄及50~60日龄。【结论】0~10日龄,羔羊生长发育很快,必须让羔羊吃上初乳以及应加强母羊的哺乳。20~50日龄是新吉细毛羔羊生长发育较快的时期,应对羔羊加强饲养管理和满足其营养供给。饲养管理较好的羊群羔羊生长快,日增重高。

非遗传因素对新吉细毛羊主要经济性状的影响

为研究非遗传因素对新吉细毛羊主要经济性状的影响,本文运用SAS9.2软件GLM程序分析非遗传因素对新疆塔城地区新吉细毛羊9个周岁鉴定性状的影响。结果表明:出生年份对体型评分、毛长、密度评分、细度支数、细度匀度评分、弯曲评分、油汗评分、总评分有极显著影响,对头毛评分没有显著影响;群别对头毛评分、体型评分、毛长、密度评分、细度支数、细度匀度评分、弯曲评分、油汗评分、总评分均有极显著影响;性别对头毛评分、体型评分、毛长、密度评分、细度支数、细度匀度评分、弯曲评分、总评分有极显著影响,对油汗评分没有显著影响。由此可见,出生年份、群别及性别对新吉细毛羊的主要经济性状存在显著影响,因此在遗传参数估计中应综合考虑这3个因素。本研究为估计细毛羊遗传参数和育种值提供了参考依据。

绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析

本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2(keratin-associated protein 2,KAP2)基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463bp的KAP2基因,开放阅读框架(ORF)长414bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸(Arg)变为谷氨酰胺(Gln),属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。

非遗传因素对超细型细毛羊初生重的影响

该研究旨在分析非遗传因素对超细型细毛羊初生重的影响。收集了新疆塔城种羊场2014-2017年共2042只新生超细毛羊初生重,运用SAS9.2软件GLM程序分析了配种月份、性别、产羔月份、产羔类型和出生年份对超细型细毛羊初生重的影响。结果表明:出生年份、性别、产羔类型对超细型细毛羊初生重呈现极显著影响(P<0.01);产羔月份、配种月份对超细型细毛羊初生重影响不显著(P>0.05)。由此可见,在未来育种工作中应综合考虑出生年份、性别、产羔类型这3个因素,为后期估计超细型细毛羊主要经济性状提供参考,并为新疆超细型细毛羊的育种工作提供全面、准确的参考。

新吉细毛羊KAP1.4基因多态性分析

为了进一步了解KAP1.4基因在新吉细毛羊群体中的多态性,采用DNA测序法对新吉细毛羊和小尾寒羊基因组编码区进行测序,找出基因突变位点,然后采用PCR-SSCP技术对新吉细毛羊KAP1.4基因编码区序列进行多态性分析。结果表明:与小尾寒羊基因组比较,新吉细毛羊KAP1.4基因码区有4处突变点,分别在136bp处发生C→T的突变,在199bp处发生T→C的突变,在310bp处发生T→G的突变以及在322bp处发生A→T的突变。而且新吉细毛羊在KAP1.4基因座上检测到AA、AB、AC基因型,以A等位基因为主。因此,KAP1.4基因在新吉细毛羊群体中存在多态性,并且以AC型为主。

绵羊IGF1基因表达、多态性与毛用性能相关分析

为探讨绵羊胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF1)基因与毛用性状的关系,本实验首先通过RT-PCR(Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction)法从新吉细毛羊皮肤组织中克隆出IGF1基因,并利用ELISA和qRT-PCR(Quantity reverse transcript polymerase chain reaction)法检测比较新吉细毛羊和小尾寒羊外周血和皮肤组织中IGF1表达差异,再利用HRM(High-resolution melting)方法检测IGF1基因在新吉细毛羊、小尾寒羊和陶赛特羊群体中的多态性,最后进行单因素方差分析检验IGF1不同基因型与新吉细毛羊毛用性状的相关性。结果表明绵羊皮肤组织中表达IGF1基因,新吉细毛羊外周血和皮肤组织中的IGF1表达水平略高于小尾寒羊,但差异不显著。PCR测序结果显示存在c.110 C>T和c.153 T>C多态性位点,其中c.110 C>T引起a.37 Ala>Val突变。进一步HRM方法结合测序结果显示新吉细毛羊、小尾寒羊和陶赛特绵羊三个群体中c.153 T>C存在三种基因型(TT、CT、CC),TT纯合型在三个群体中频率最低,且在新吉细毛羊群体内呈现出Hardy-weinberg极度不平衡状态(p<0.0001)。单因素方差分析结果显示TT基因型在拉伸长度和产毛量指标方面高于CC基因型(p<0.05)。绵羊IGF1基因多态性的发现与毛用性状相关分析将为绵羊毛用性状育种实践奠定基础。

“新吉”细毛羊改良当地绵羊的效果

实践证明,以"新吉"细毛羊为父本对东北细毛羊进行改良能够显著提高改良羊群的产毛性能,对原毛产量、净毛率、羊毛长度和细度的提高效果明显。改良率、羊毛长度和细度的提高效果明显。改良F_2代羊毛细度从东北细毛羊母本的60～64 s(24.3μm)提高到了66～70 s(20.7μm),羊毛长度从7.2 cm提高到8.1 cm,净毛率从38.5%提高到45.8%,原毛单产从4.0kg提高到5.1 kg。特别是净毛单产从1.54kg提高到2.34 kg,提高了0.80 kg,增产幅度高达51.95%。

新吉细毛羊KAP13.1基因多态性及其对部分经济性状的影响

本试验采用DNA测序和PCR-SSCP技术,对176只新吉细毛羊KAP13.1基因编码区序列进行多态性分析,并利用最小二乘模型对其多态性与其产毛量、细度、拉伸长度、体质量的关联性进行系统分析。测序表明KAP13.1基因在291bp处发生T→C的突变,在469、528bp处发生C→T的突变,均属同义突变,在T291C位点,CC基因型拉伸长度显著高于TT基因型(P<0.05),而与CT型无显著差异。在C469、528T位点NN基因型的产毛量和拉伸长度显著高于MM型(P<0.05),而与MN基因型无显著差异,其他性状在2个位点的不同基因型间差异不显著。结果表明KAP13.1基因可作为影响新吉细毛羊产毛量和拉伸长度性状的分子标记。