基于全基因组重测序分析新疆细毛羊遗传多样性

【目的】基于全基因组重测序研究新疆细毛羊遗传多样性。【方法】利用新疆细毛羊的全基因组重测序数据和NCBI下载获得的策勒黑羊、巴音布鲁克羊、阿勒泰羊全基因组重测序数据,检测不同绵羊品种的核苷酸多态性和单倍型多态性,评估其遗传多样性现状,计算群体分化指数、观望/观测杂合度,分析遗传多样性,评价不同绵羊品种现有的遗传变异水平。【结果】全基因组重测序获得了97647435个高质量的常染色单核苷酸多态性(SNP)位点和15886270个插入或缺失(Indel);新疆细毛羊的遗传多样性水平显著低于阿勒泰羊,低于巴音布鲁克羊,略高于策勒黑羊;4个绵羊群体遗传多样性顺序:阿勒泰羊>巴音布鲁克羊>策勒黑羊>新疆细毛羊。【结论】选取的4个绵羊群体中,新疆细毛羊的遗传多样性水平相对较低。

The Production of Monoclonal Antibody to Androstenedione and the Effect of Passive Immunization on Xinjiang Fine-Wool Sheep With It

Five hybridomas stably secreting monoclonal antibodies (McAbs) to androstenedione were prepared by using artificially synthesized androstenedione-11α-succinyl conjugate with bovine serum albumin (BSA) as antigen. These McAbs showed slightly high cross-reactivity with testosterone (8.1—12.3%) and estrone (0.8—2.5%) and high affinities ranging from 2.0×10~7 to 2.8×10~8 L/M. They were all of the IgG_1 subclass. Xinjiang finewool ewes which were passively immunized with McAbs had higher circulating levels of progesterone (P) and luteinizing hormone (LH) than those of control ewes in two oestrous cycles and these changes led to increased ovulation rate and twin lambs born in young ewes.

日粮类型对细毛羊甲烷排放及代谢物碳残留的影响

为探索减少或控制反刍动物向大气中排放污染物的方法,该文就日粮类型对绵羊甲烷排放及代谢物中碳残留的影响进行探讨。试验选择60只4月龄、体重为25kg左右的新疆细毛羊进行完全随机试验设计分成4组。Ⅰ组和Ⅱ组日粮精粗比为2:8,Ⅲ组和Ⅳ组日粮精粗比为4:6,Ⅰ组和Ⅲ组粗饲料为玉米秸秆,Ⅱ组和Ⅳ组粗饲料为玉米青贮。结果表明,用玉米青贮完全替代玉米秸秆饲喂绵羊时,甲烷产量Ⅱ组比Ⅰ组显著降低(P<0.01),Ⅳ组比Ⅲ组降低了12%(P>0.05)。当粗饲料为玉米秸秆时,产甲烷效率随日粮精粗比的提高显著降低(P<0.05)。当粗饲料为玉米青贮时,产甲烷效率组间差异不显著(P>0.05)。代谢物中的碳残留量Ⅳ组比Ⅰ组显著降低(P<0.05),Ⅱ组和Ⅳ组分别比Ⅰ组和Ⅲ组降低16.67%和9.09%(P>0.05)。研究结果表明,日粮类型对新疆细毛羊排放甲烷有显著影响,同时也影响其代谢物中碳的残留量。

湖羊和新疆细毛羊妊娠早期内分泌比较

为比较多胎与单胎绵羊妊娠早期生殖内分泌的差异，应用酶免疫测定法（EIA）和放射免疫测定法（RIA）检测江苏湖羊和新疆细毛羊妊娠早期血清孕酮（P）、雌二醇（E2）、促黄体素（LH）、前列腺素和瘦素水平。试验结果表明：湖羊血清孕酮、瘦素水平在妊娠13～43d极显著高于新疆细毛羊（P〈0．01），血清前列腺素水平在妊娠13～30d极显著低于新疆细毛羊（P〈0．01），而雌二醇、促黄体素水平在妊娠13～43d与新疆细毛羊无显著差异（P〉0．05）。这为湖羊多胎作用机制的研究提供了参考。

新疆细毛羊超数排卵效果研究

【目的】提高并稳定新疆细毛羊超数排卵效率,为以生产2～8-细胞期胚胎的转基因研究提供素材。【方法】分别从激素生产厂家、供体年龄、激素处理方案等3个方面探讨新疆细毛羊的超数排卵效果,确定新疆细毛羊超数排卵供体羊的最佳年龄及其有效处理方案。【结果】不同生产厂家的激素对新疆细毛羊黄体数和可用胚胎数均存在极显著影响(P<0.01);1.5周岁以内的新疆细毛羊超排后,其黄体数(6.17个/只)和可用胚胎数(1.50枚/只)均极显著低于2.0周岁以上的新疆细毛羊(黄体数12.24个/只,可用胚胎数8.30枚/只)(P<0.01);FSH剂量在150～200U/只范围内不影响超排效果和胚胎质量(P>0.05);FSH+PMSG超排处理的新疆细毛羊黄体数(6.05个/只)和可用胚胎数(1.76枚/只)则显著低于FSH+PG超排处理(黄体数17.11个/只,可用胚胎数10.38枚/只)(P<0.01)。【结论】新疆细毛羊超数排卵时宜选用2.0周岁以上的供体羊,FSH剂量控制在150～200U/只,若能与PG联合使用其超排效果更好,但不宜与PMSG联合使用。

藏系绵羊(贾洛、红原、欧拉类群)、新疆细毛羊与阿勒泰羊血液蛋白多态性的研究

为了研究草地藏系绵羊(贾洛类群、红原类群、欧拉类群)和新疆细毛羊及阿勒泰羊的遗传多样性,试验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳对以上5个类群羊的运铁蛋白(Tf)、血红蛋白(Hb)、乳酸脱氢酶(LDH)遗传多样性进行了研究。结果表明:Tf及Hb 2个位点草地藏系绵羊贾洛类群的多态程度最低;分析草地藏系绵羊红原类群LDH同工酶时出现5个条带,另外在红原类群的LDH中还发现了类似于牦牛中发现的LDH-B基因突变导致的遗传多态性现象,其他类群中均未发现LDH4、LDH5。

新疆细毛羊pEGFP-C2-KAP6.1真核表达质粒的构建与鉴定

试验采集新疆细毛羊皮肤组织,提取RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出KAP6.1基因,并通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-C2真核表达载体上,构建pEGFP-C2-KAP6.1重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定。结果表明,本试验成功构建了新疆细毛羊的pEGFP-C2-KAP6.1真核表达重组质粒,为进一步研究该基因所编码的蛋白与毛品质的关系,以及培育超细羊毛等经济性生物学性状相互关系提供理论依据。

新疆细毛羊KAP6.1基因的克隆及序列分析

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP)6.1(登录号为AY483218.1)基因序列设计合成2个特异性引物,以新疆细毛羊为研究对象,从采集的皮肤组织中提取RNA进行RT-PCR反应,扩增出长度为320 bp的特异性片段,回收目的片段并连接至pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,检测阳性克隆、测序并进行分析。结果表明:试验成功克隆了新疆细毛羊KAP6.1基因,得到的长度为320 bp序列中包含252 bp的编码区序列。新疆细毛羊与绵羊亲缘关系最近,同源性为99.2%,与山羊同源性为94.8%,有13处核苷酸差异与人和兔的同源性分别为80.8%、75.1%。

新疆细毛羊2倍基因组BAC文库PCR筛选系统的构建与使用

本研究所构建的BAC文库覆盖了8倍新疆细毛羊的基因组，平均插入片段的大小为133kb．同时文库92．5％的克隆插入片段大于100kb，而且有部分克隆甚至大于300kb，假定绵羊的基因组含有3×10^6kb，根据文库的平均插入片段大小为133kb，从文库筛选到目的片段的概率为98．208％。为了验证文库有较好的覆盖率．构建了2倍基因组文库PCR筛选系统，并对位于新疆细毛羊20号染色体MHC基因邻近区段的DMB_EX2、MCMA36、CP73和BM12584个分子标记进行了筛选．得到的平均阳性克隆数为1．5个，从筛选结果来看，这与文库插入片段估计的8倍基因组覆盖率相当接近并且没有偏向，这使得本文库成为研究绵羊的功能基因、位置克隆和完善基因组物理图谱的极为有用的资源。

新疆细毛羊抑制素α亚基cDNA的克隆、序列分析与表达

根据GenBank上登录的绵羊抑制素α亚基基因序列,设计合成2对引物,以新疆细毛羊卵巢提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增获得了约812 bp片段,经pMD18-T载体克隆和测序分析证实为新疆细毛羊抑制素α亚基前体基因。进一步通过PCR反应扩增新疆细毛羊INHα亚基基因片段,经过NcoⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆于pET32a原核表达载体,获得pET-INH重组表达载体。将携带有重组表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)通过1 mmol.L-1IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大约为32 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。新疆细毛羊抑制素α亚基基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。

新疆军垦型细毛羊基因组BAC文库的构建

选用新疆特有的军垦型细毛羊为材料,构建了含有190464个克隆的全基因组BAC文库.文库的平均插入片段大小为133kb,同时文库92.5%克隆插入片段大于100kb,而且有部分克隆甚至大于300kb,这将满足大多数基因筛选的要求.假定绵羊的基因组含有3×106kb,根据文库的平均插入片段大小为133kb,计算的文库基因组覆盖率为8倍.因此,从文库筛选到目的片段的概率为98.208%.该文库中插入的外源片段来自新疆军垦型细毛羊的基因组,这对于研究新疆军垦型细毛羊的特殊性状的基因与其它绵羊品种和物种之间的差异,以及构建其全基因组物理图谱和基因图谱的完善是非常有利的.

新疆细毛羊早期不同年龄间生产性状的相关估测

通过对新疆南山种羊场１９９４年出生的新疆细毛羊的 ９月龄的羔羊和１５月龄的育成羊分别测定其重要经济性状，并进行性别内相关分析，得出如下结论：９月龄羔羊和１５月龄育成羊间的毛束长度、净毛质量的相关系数均高于０.６，而体质量、纤维直径的相关数则大于０.３。

新疆细毛羊leptin基因第二、三外显子扩增片段的多态性分析

根据leptin基因在GenBank中的已知序列设计两对引物,采用PCR-SSCP和DNA测序技术在新疆细毛羊群体中进行单核苷酸多态性(SNPs)检测分析。结果表明,新疆细毛羊leptin基因第二、三外显子都具有多态性。其中,第二外显子扩增片段上有AA和AB两种基因型,AA基因型为优势基因型;而在第三外显子有CC、CD两种基因型,以CC基因型为优势基因型。并且经过DNA测序发现,在leptin第一内含子上有两处突变,即TTG三个连续碱基的插入和C→T的碱基替换;而在第三外显子上发生了G→T替换突变。

新疆军垦型细毛羊MHC基因临近区段3个遗传标记的研究

比较基因组学是基因组学的重要分支,现已成研究生物基因组的最重要的策略与手段。研究发现绵羊与牛及山羊之间基因组序列的同源性或同线性程度要高于其他物种,能利用牛和山羊的基因组研究结果进行比较基因组学研究,进而阐明绵羊的基因组功能。试验采用琼脂糖凝胶电泳技术,对新疆军垦型细毛羊20号染色体MHC基因邻近区段的DMB-EX2、MCMA36、CP73三个分子标记分别进行了PCR产物的检测、测序和同源性比对。结果表明,这3个序列均与相关物种的对应序列具有很高的同源性:DMB-EX2与牛的对应序列的同源性为89%,MCMA36与山羊的对应序列的同源性为97%,CP73与羊的对应序列的同源性为96%。

湖羊FecB基因在新疆细毛羊胎儿成纤维细胞中的表达

为培育携带FecB多胎基因的高繁殖率新疆细毛羊,本研究提取了湖羊卵巢的总RNA,在此基础上反转录为cDNA,通过PCR扩增得到了湖羊的FecB基因,再与pMD19-T载体连接,构建了pMD19-T-FecB重组质粒。通过双酶切与真核表达载体pEGFP-N1连接,得到了pEGFP-N1-FecB真核表达载体。经测序与酶切证明,成功构建了pEGFP-N1-FecB真核表达载体,并转染新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,通过药物筛选获得了表达湖羊FecB基因的阳性新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,为培育高繁殖率的新疆细毛羊奠定基础。

青海细毛羊、新疆细毛羊和藏系绵羊染色体比较研究

采用外周血微量全血培养法研究了生活在青海省三角城种羊场的青海细毛羊、新疆细毛羊、藏系绵羊的染色体核型及畸变。结果表明：三种绵羊二倍体细胞的染色体数目均为２ｎ＝５４，ＮＦ＝６２，公羊核型为５４，ＸＹ；母羊为５４，ＸＸ。染色体畸变类型主要为结构断裂和多倍体，其频率分别为：青海细毛羊１．５３０％和１．８４４％；新疆细毛羊２．２９２％和１．５６８％；藏系绵羊２．０２２％和１．１０３％，并对三种羊的畸变类型进行下检验，结果差异均为极显著（Ｐ＜０．０１）。

引入青海的新疆细毛羊生化遗传多态性的研究Ⅲ.钾型和运铁蛋白基因型与生产性状的联系

研究了引入青海的新疆细毛羊钾型和运铁蛋白基因型与初生重、断奶重、周岁重、周岁毛长和周岁产毛量之间的联系。结果发现:除了 LK 型羊的周岁毛长显著大于HK 型羊(P<0.05)以外,钾型和运铁蛋白基因型与生产性状之间均无显著性联系。

藏羚羊绒、山羊绒、绵羊绒与细羊毛纤维全长微观特征扫描电镜分析

应用扫描电子显微镜对藏羚羊绒、新疆山羊绒、阿勒泰绵羊绒、新疆细羊毛四种纤维进行了全长检测。结果表明藏羚羊绒直径10.58μm±1.65μm,鳞片类型以斜绕长冠状型为主;新疆山羊绒直径14.36μm±2.41μm,鳞片为典型冠状;阿勒泰绵羊绒直径20.09μm±5.55μm,鳞片为冠状型、过渡型;新疆细羊毛直径18.14μm±4.15μm,波动频繁,卷曲节点极多,鳞片为冠状型和过渡型。四种纤维鳞片厚度平均值均大于0.5μm。

引入青海的新疆细毛羊生化遗传多态性的研究——Ⅳ.血清淀粉酶

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对引入青海的新疆细毛羊１１８份血样进行了血清淀粉酶多态性的研究。结果表明血清淀粉酶有ＡＭＹ１，ＡＭＹ２和ＡＭＹ３三种同工酶，只有ＡＭＹ２存在多态性。

青海省绵羊血红蛋白多态性的研究

采用醋酸纤维素薄膜电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳对青海省藏羊、青海细毛羊、青海半细毛羊、新疆细毛羊、茨盖羊、小尾寒羊、澳大利亚美利奴及其杂种的4 052份血样进行了血红蛋白多态性的研究,列表举出了每一地区不同品种绵羊血红蛋白的基因型频率、基因频率和基因杂合度,讨论了青海省绵羊血红蛋白多态性的特征。