心阳片改善低压低氧致右心衰竭模型大鼠右心结构和功能及其可能的作用机制

目的探究心阳片通过调节肠道菌群改善高原低氧致右心衰竭(RVF)的作用机制。方法SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、模型+心阳片(270 mg·kg^(-1))组和模型+卡托普利(30 mg·kg^(-1))组(阳性对照),每组6只。除正常对照组外,其余3组均置于模拟海拔5500 m的低压氧舱内,采用慢性低压低氧诱导RVF大鼠模型。从造模第1天开始ig给药,每天1次,持续21 d。用PE导管检测大鼠血流动力学变化,ELISA检测血清脑钠肽(BNP)含量,计算右心肥厚相关指数,HE和Masson染色法观察右心组织病理改变;采用16S rRNA测序分析大鼠直肠粪便肠道菌群的多样性和组成;Western印迹法检测大鼠右心组织G蛋白偶联受体43(GPR43)、白细胞介素6(IL-6)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-mTOR蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,模型组大鼠右心室收缩压(RVSP)、右心室舒张末压(RVEDP)和右心室压力最大上升速率(+dp/d_(tmax))显著升高(P<0.01),而右心室压力最大下降速率(-dp/d_(tmin))降低(P<0.01),血清BNP含量升高(P<0.01),右心肥厚指数和纤维化程度增加(P<0.01);与模型组相比,心阳片组大鼠上述指标明显改善(P<0.05)。肠道菌群测序分析显示,与正常对照组比较,模型组大鼠肠道菌群多样性降低,厚壁菌门/拟杆菌门比例升高(P<0.05),阿克曼菌科、粪厌氧棒杆菌属和罗氏菌属菌群丰度降低(P<0.05);心阳片处理可逆转RVF模型大鼠上述肠道菌群的异常变化(P<0.05),且粪厌氧棒杆菌属和罗氏菌属菌群丰度与RVSP、+dp/d_(tmax)、血清BNP含量及右心纤维化程度呈负相关(P<0.05)。Western印迹法结果显示,模型组右心组织GPR43和IL-6蛋白表达水平及Akt和mTOR蛋白磷酸化水平较正常对照组均显著升高(P<0.05);与模型组比较,心阳片组GPR43和IL-6蛋白表达及Akt和mTOR蛋白磷酸化水平均明显下降(P<0.05)。结论心阳片可改善低压低氧所致RVF模型大鼠右心结构和功能,抑制心肌炎症反应,其机制可能与提高肠道菌群多样性和丁酸产生菌的相对丰度及抑制AKT/mTOR信号通路活化有关。

心阳片含药血清调控MLK3介导的铁死亡对心肌细胞的保护作用及机制研究

目的探讨心阳片含药血清调控MLK3介导的铁死亡对心肌细胞的保护作用及机制。方法20只SD大鼠随机分为对照组和含药血清组,含药血清组按照人与动物体表面积等效剂量换算,给予心阳片0.24 g/kg进行灌胃,每日2次,对照组给予等量生理盐水灌胃,连续灌胃7 d后制备血清。将心肌细胞HL-1分为空白组(Control)、FIN56组、FIN56+URMC-099组(FIN56+U-099)、FIN56+心阳片含药血清组(FIN56+XYP)。收集上述各组细胞,ROS荧光染色检测HL-1细胞活性氧水平,测定HL-1细胞MDA、T-SOD和GSH表达水平,RT-PCR检测各组细胞ANP和BNP mRNA水平,Western Blot法检测各组细胞MLK3、p53、GPX4和FTH1蛋白表达水平。结果与空白组相比,FIN56组细胞ROS、MDA表达水平显著升高(P<0.01),T-SOD和GSH表达水平降低(P<0.01)。ANP和BNP mRNA表达水平显著升高(P<0.01),MLK3和p53蛋白表达水平显著升高(P<0.01),GPX4和FTH1蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与FIN56组比较,给予URMC-099和心阳片含药血清能降低ROS、MDA表达水平(P<0.01),升高T-SOD和GSH表达水平(P<0.01)。显著抑制ANP和BNP mRNA的表达(P<0.01)以及MLK3和p53蛋白表达(P<0.01),激活GPX4和FTH1蛋白表达(P<0.01)。结论心阳片含药血清可能通过调控MLK3,抑制心肌细胞铁死亡改善心肌损伤。

心阳片含药血清调控NLRP3介导细胞焦亡保护心肌细胞炎症损伤的作用及机制研究

目的通过观察心阳片含药血清调控NLRP3介导的细胞焦亡对心肌细胞炎症损伤的保护作用,探讨心阳片防治心力衰竭的作用机制。方法随机将40只雄性SD大鼠分成空白组、心阳片低、中、高剂量组,分别给予临床等效剂量的1、2、4倍心阳片(0.24、0.48、0.96 g/kg)灌胃;空白组给予等量蒸馏水进行灌胃。各组大鼠灌胃2次/d, 2 mL/次,连续灌胃7 d。末次给药灌胃后,腹主动脉取血,分离血清。用LPS/ATP(1μg/mL LPS刺激细胞24 h,再用5 mmol/L ATP刺激细胞4 h)处理HL-1心肌细胞,并分为:空白组(NC)、模型组(LPS/ATP+空白血清)、心阳片低剂量组(LPS/ATP+低剂量心阳片血清)、心阳片中剂量组(LPS/ATP+中剂量心阳片血清)、心阳片高剂量组(LPS/ATP+高剂量心阳片血清)。CCK8检测细胞活性,免疫荧光检测各组细胞NLRP3的表达情况,RT-qPCR检测NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1mRNA转录水平,Western Blot检测心肌细胞NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β、IL-18、cleaved-GSDMD、pro-Caspase-1、Caspase-1、ASC蛋白表达情况。结果与空白组相比,LPS/ATP组HL-1细胞活力明显降低,NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1mRNA水平升高(P<0.05),NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β、IL-18、cleaved-GSDMD、pro-Caspase-1、Caspase-1、ASC蛋白表达明显升高(P<0.05);与LPS/ATP组相比,心阳片含药血清低、中、高剂量组细胞活力增加,NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1mRNA水平降低(P<0.05),NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β、IL-18、cleaved-GSDMD、pro-Caspase-1、Caspase-1、ASC蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论心阳片含药血清能改善LPS/ATP诱导HL-1细胞炎症损伤,其机制可能是通过抑制NLRP3/IL-1β介导的细胞焦亡发挥作用。

心阳片通过抑制骨桥蛋白介导的心脏纤维化信号改善尿毒症心肌病小鼠的作用和机制

目的:探究心阳片通过调控骨桥蛋白(OPN)介导的心脏纤维化信号改善尿毒症心肌病(UCM)小鼠的作用和机制。方法:采用5/6肾切除(NPM)术构建UCM小鼠模型,并随机分为模型组、心阳片组、美托洛尔组,每组15只,另外15只假手术小鼠作为假手术组。心阳片组、美托洛尔组术后分别给予心阳片(0.34g/kg)、美托洛尔(0.35g/kg)灌胃,假手术组及模型组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃,治疗8周。给药1、4、8周使用小动物超声观察小鼠心功能变化;8周后观察、检测小鼠毛发光泽、精神状态、抓力、自主活动次数和肛温等阳虚证候表现;检测小鼠血肌酐、尿素氮水平;WGA染色法、TUNEL染色法、天狼猩红染色法观察小鼠心脏组织形态学变化及胶原纤维沉积情况;qPCR法检测小鼠心脏纤维化相关基因mRNA表达;免疫荧光法观察小鼠心脏α-SMA表达;通过心脏转录组数据联合实验手段探究心阳片改善UCM心脏纤维化的作用和机制。结果:与模型组比较,心阳片改善UCM小鼠毛发光泽和精神状态,改善抓力、自主活动次数和肛温(P<0.05);改善心脏收缩和舒张功能(P<0.05);改善心肌细胞面积(P<0.05);减少凋亡心肌细胞数量(P<0.05);减少心脏纤维化面积(P<0.05);降低纤维化相关基因(acta2、collal、col2al、mmp3、mmp9)mRNA表达和α-SMA蛋白表达(P<0.05);而对血肌酐和尿素氮水平无明显影响。基因集富集(GSEA)分析结果显示心阳片抑制OPN信号。免疫荧光结果显示心阳片降低UCM小鼠心脏心肌细胞、巨噬细胞与成纤维细胞OPN蛋白表达(P<0.05);qPCR结果表明心阳片降低心脏巨噬细胞spp1mRNA表达(P<0.05);ELISA检测结果表明心阳片降低血清OPN水平(P<0.05)。然而,OPN表达升高能够抵消心阳片对心脏纤维化的改善作用(P<0.05)。结论:心阳片能有效改善UCM,其作用机制可能是通过抑制OPN介导的心脏纤维化信号实现。

心阳片通过抑制AGEs介导的心脏成纤维细胞激活改善心力衰竭小鼠心肌纤维化的作用机制

目的探讨心阳片(吉林参、淫羊藿、黄芪、益母草、毛冬青等)通过抑制晚期糖基化终产物(Advanced glycation end-products,AGEs)介导的心脏成纤维细胞激活改善心力衰竭小鼠心肌纤维化的作用机制。方法将48只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组、培哚普利组(0.61 mg·kg^(-1))及心阳片低、中、高剂量组(455、910、1820 mg·kg^(-1)),每组8只。采用横向主动脉缩窄(Transverse aortic constriction,TAC)法建立心力衰竭小鼠模型。造模成功后,按照上述剂量灌胃给药,每天1次,连续6周。采用超声心动图检测小鼠心功能:左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS);免疫组织化学法测定小鼠心脏组织AGEs的表达;qPCR法检测小鼠心脏组织中vimentin、FSP1及纤维化相关基因collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、fibronectin、CTGF的mRNA表达;Western Blot法检测小鼠心脏组织中vimentin蛋白的表达;Masson染色法观察小鼠心肌纤维化程度。结果与假手术组比较,模型组小鼠的LVEF、LVFS显著降低(P<0.01);小鼠心脏组织中的AGEs表达显著上调(P<0.01),vimentin、FSP1 mRNA表达及vimentin蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01);心脏组织中有大量胶原纤维沉积,collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、fibronectin、CTGF mRNA表达均显著上调(P<0.01)。与模型组比较,心阳片低、中、高剂量组及培哚普利组小鼠的LVEF、LVFS均明显升高(P<0.05,P<0.01);小鼠心脏组织中的AGEs表达均显著下调(P<0.01),vimentin、FSP1 mRNA表达及vimentin蛋白表达均明显下调(P<0.05,P<0.01);心脏组织中无明显胶原纤维沉积,collagenⅠ、collagen Ⅲ、fibronectin、CTGF mRNA表达均明显下调(P<0.05,P<0.01)。结论心阳片可以有效改善心力衰竭小鼠的心肌纤维化,可能与其抑制AGEs介导的心脏成纤维细胞激活有关。

心阳片抑制MLK3/JNK/P53介导的心肌细胞铁死亡抗慢性心力衰竭的作用及机制研究

目的:探讨MLK3/JNK/p53介导的心肌细胞铁死亡在慢性心力衰竭(CHF)中的作用机制及心阳片的干预作用。方法:随机将80只C57BL/6J小鼠分为假手术组,模型组,URMC-099+假手术组,URMC-099组,心阳片低、中、高剂量组,培哚普利组,采用胸主动脉缩窄(TAC)术复制压力负荷CHF模型。心阳片低、中、高剂量组分别给予心阳片0.34、0.68、1.36g/kg灌胃,培哚普利组给予培哚普利0.607mg/kg灌胃,URMC-099组给予URMC-099 10mg/kg,2次/d,于造模1周前开始腹腔注射,假手术组和模型组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。连续给药8周后,小动物超声检测各组小鼠心功能,HE染色检测各组小鼠心脏组织形态学变化,Masson染色检测各组小鼠心脏胶原纤维沉积情况,Western Blot检测心脏组织MLK3、JNK、p53、COX2、xCT、GPX4、FTH1蛋白表达情况。结果:与假手术组比较,模型组小鼠LVEF和LVFS值显著降低(P<0.01),心脏细胞形态明显增大,排列不规则,有较多炎性细胞聚集及胶原纤维沉积,MLK3、JNK、p53、COX2蛋白水平显著升高(P<0.01),xCT、GPX4、FTH1水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,各治疗组治疗后各项指标均得到显著改善(P<0.01)。结论:心阳片能抑制心肌纤维化来有效改善CHF小鼠心功能,其机制可能是通过抑制MLK3/JNK/p53介导的心肌细胞铁死亡发挥作用。

基于转录组学与网络药理学探讨心阳片防治慢性心力衰竭的机制

目的基于转录组学与网络药理学探讨心阳片防治慢性心力衰竭(CHF)的关键机制。方法将32只小鼠随机分为假手术组、模型组、心阳片组(910 mg·kg^(-1))、培哚普利组(阳性对照组,0.607 mg·kg^(-1))。采用主动脉弓缩窄术(TAC)构建CHF小鼠模型。造模成功后,按照上述剂量灌胃给药(10 mL·kg^(-1)),每日1次,连续给药8周。给药结束后,对小鼠行心脏彩超检测,采集左室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(LVFS)等心功能指标;采用Masson染色法观察心脏组织病理形态变化。取小鼠心脏组织提取RNA进行转录组测序,并对组间差异基因进行GO功能及KEGG通路富集分析。通过TCMSP平台以及文献检索筛选心阳片的活性成分,利用SwissTargetPrediction网站预测活性成分作用靶点。通过Venny平台对转录组测序得到的交集差异基因与活性成分作用靶点取交集,获得交集靶点(心阳片治疗CHF的关键靶点)。利用STRING平台构建交集靶点蛋白互作(PPI)网络;通过Cytoscape 3.8.0软件构建"中药-活性成分-关键靶点网络"网络,筛选出心阳片防治CHF的核心靶点,并对核心靶点进行KEGG通路富集分析;采用qPCR法检测核心靶点mRNA表达。结果与假手术组比较,模型组小鼠的LVEF、LVFS均显著降低(P<0.01),小鼠的心脏体积明显增大,心脏系数显著升高(P<0.01),心脏胶原容积分数明显升高(P<0.05)。与模型组比较,给药组小鼠的LVEF、LVFS均显著升高(P<0.01),小鼠的心脏体积明显缩小,心脏系数显著降低(P<0.01);心阳片组小鼠的心脏胶原容积分数明显下降(P<0.05),培哚普利组的变化无明显差异(P>0.05)。共得到心阳片有效成分83个;假手术组-模型组的差异基因与模型组-心阳片组差异基因的交集差异基因共有354个,进一步与心阳片主要活性成分的771个作用靶点取交集,共得到21个交集靶点,即心阳片治疗CHF的关键靶点。心阳片改善CHF的核心靶点包括CCNB1、CCNA2、CDK1、PLK1、TNF、ALOX5、CCND1;KEGG信号通路主要富集在细胞周期、细胞衰老、FoxO、AMPK、p53、肥厚型心肌病、糖尿病并发症中的AGE-RAGE等。结论心阳片可明显改善CHF小鼠的心功能,减轻小鼠心脏的纤维化面积以及肥厚程度,与其多成分、多靶点、多信号通路发挥的协同作用机制相关。

基于RyR2调控Ca^(2+)信号探讨心阳片防治慢性心力衰竭的机制

目的:基于兰尼碱受体2(RyR2)调控钙信号通路的作用,探讨心阳片防治慢性心力衰竭(CHF)的作用机制。方法:随机将40只C57BL/6J小鼠分为假手术组、模型组、溶媒组、心阳片组,予以主动脉弓缩窄术制作CHF模型,连续予以8周同时段内给药处理后,予心脏超声检测小鼠心脏LVIDs、LVIDd、LVEF、LVFS等变化。用HE和Masson染色检测各组中动物心脏病理改变,q-PCR检测各组小鼠ANP、BNP、CollagenⅠmRNA的表达,并用Western Blot检测各组细胞RyR2/Calpain/NF-κB信号通路相关蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组、溶媒组LVEF、LVFS水平显著降低(P<0.01)、LVIDs及LVIDd显著升高(P<0.01);模型组及溶媒组心肌组织纤维蓝染面积显著增加(P<0.01);模型组及溶媒组ANP、BNP、CollagenⅠmRNA水平显著升高(P<0.01,P<0.05);模型组及溶媒组心肌中RyR2/Calpain/NF-κB通路蛋白的表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组、溶媒组比较,心阳片组LVEF、LVFS水平显著升高(P<0.01)、LVIDs及LVIDd均显著降低(P<0.01);心阳片组心肌组织纤维蓝染面积显著减少(P<0.01);ANP、BNP、CollagenⅠmRNA表达减低(P<0.01);心阳片组心肌组织中RyR2/Calpain/NF-κB p65通路蛋白表达水平均降低(P<0.01,P<0.05)。结论:心阳片可能通过减轻RyR2/Calpain/NF-κB通路活性来改善心肌兴奋-收缩耦联进而改善CHF心室重构。

心阳片对缺氧诱导大鼠肺血管重构的影响

目的探讨心阳片(黄芪、红参、淫羊藿等)对缺氧诱导大鼠肺血管重构的影响及其作用机制。方法将雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、心阳片组(270 mg·kg^(-1))和卡托普利组(阳性对照,30 mg·kg^(-1)),每组7只。将大鼠置于全自动低压低氧实验环境舱中,模拟海拔5500 m的气候环境,连续低压缺氧21 d,建立大鼠肺血管重构模型。采用苏木素-伊红(HE)染色法观察各组大鼠肺小动脉血管病理学形态变化,马松(Masson)染色法观察肺组织纤维化程度;蛋白免疫印迹(Western Blot)法测定肺组织肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6蛋白表达水平,酶联免疫吸附法(ELISA)测定肺组织TNF-α、IL-6含量变化;16S rRNA基因测序法检测各组大鼠肠道菌群多样性和菌群组成的变化,并分析肠道菌群与肺血管重构及纤维化之间的相关性。结果与正常组比较,模型组大鼠肺血管壁厚度和肺纤维化面积明显增加(P<0.001,P<0.01);肺组织中TNF-α、IL-6蛋白表达水平(P<0.05)及含量(P<0.001,P<0.01)均明显升高;肠道菌群多样性明显减少(P<0.01),菌群组成发生改变,放线菌、丹毒丝菌及罗姆布茨菌的菌群相对丰度均明显降低(P<0.05)。与模型组比较,心阳片组大鼠肺血管壁厚度和肺纤维化面积明显减小(P<0.01,P<0.05);肺组织中TNF-α、IL-6蛋白表达水平及含量均明显降低(P<0.01);肠道菌群多样性增加(P<0.05),放线菌、丹毒丝菌及罗姆布茨菌的菌群相对丰度均明显升高(分别P<0.05,P<0.01,P<0.05),且丁酸盐产生菌丹毒丝菌的相对丰度与肺血管壁厚度及纤维化程度呈负相关(P<0.01,P<0.05)。结论心阳片能够减轻缺氧诱导的肺血管重构及纤维化程度,其作用机制可能与抑制肺组织炎症,调节肠道菌群多样性及组成,提高丁酸盐产生菌的菌群丰度有关。

心阳片通过抑制心肌细胞自噬改善心力衰竭小鼠心功能的作用研究

目的探讨心阳片调节心肌细胞自噬改善心力衰竭(Heart failure,HF)小鼠心功能的作用机制。方法将48只雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组,模型组,心阳片低、中、高剂量组(455、910、1820 mg·kg^-1)及3-甲基腺嘌呤组(15 mg·kg^-1,腹腔注射给药),每组8只;采用主动脉弓缩窄术复制HF小鼠模型;按上述剂量灌胃给药,灌胃体积为8 mL·kg^-1,每天给药1次,连续4周。采用心脏彩超检测各组小鼠心功能:小鼠左心室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(LVFS);采用q PCR法检测小鼠心脏组织HF生物标记物B型钠尿肽(BNP)mRNA的表达;采用Western Blot法检测小鼠心肌细胞自噬相关蛋白Beclin-1及LC3BⅡ/Ⅰ的表达。结果与假手术组比较,模型组小鼠的LVEF、LVFS显著降低(P<0.05),BNP mRNA及Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达明显上调(P<0.05)。与模型组比较,心阳片低、中、高剂量组及3-甲基腺嘌呤组小鼠的LVEF、LVFS显著升高(P<0.05),BNP mRNA及Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论心阳片可能通过抑制心肌细胞过度自噬改善HF小鼠的心功能。

心阳片通过调节RAGE介导的自噬改善心力衰竭小鼠心功能的作用研究

目的探讨心阳片通过调节晚期糖基化终产物受体(RAGE)介导的自噬改善心力衰竭小鼠心功能的作用。方法将60只C57BL/6J小鼠随机分为6组,分别为假手术组、模型组、3-甲基腺嘌呤组(自噬抑制剂,15 mg·kg^(-1))以及心阳片低、中、高剂量组(455、910、1 820 mg·kg^(-1)),每组10只;另将10只经基因型鉴定确认为RAGE-/-的小鼠作为RAGE敲除组。采用主动脉弓缩窄术(TAC)建立压力负荷性心力衰竭小鼠模型。模型复制成功后,按上述剂量对心阳片各剂量组小鼠进行灌胃给药,3-甲基腺嘌呤组进行腹腔注射给药,其余组别灌胃等容积生理盐水,每天给药1次,连续4周。采用心脏彩超检测各组小鼠心功能,采集小鼠左室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(LVFS);使用Masson染色观察小鼠心肌组织纤维化程度;采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测小鼠心脏左室心肌组织中的RAGE蛋白及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ的表达情况。结果与假手术组比较,模型组小鼠的LVEF及LVFS明显降低(P<0.05),心肌纤维化面积明显增加(P<0.05),RAGE蛋白及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ的表达明显上调(P<0.05);与模型组比较,RAGE敲除组、3-甲基腺嘌呤组及心阳片低、中、高剂量组小鼠的LVEF和LVFS明显升高(P<0.05),心肌纤维化面积明显减少(P<0.05),RAGE、Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论心阳片可能通过调节RAGE介导的自噬,从而改善心力衰竭小鼠的心功能。