Improved Ethanol Production from Xylose by Candida shehatae Induced by Dielectric Barrier Discharge Air Plasma

Xylose fermentation is essential for ethanol production from lignocellulosic biomass. Exposure of the xylose-fermenting yeast Candida shehatae （C. shehatae） CICC1766 to atmospheric pressure dielectric barrier discharge （DBD） air plasma yields a clone （designated as C81015） with stability, which exhibits a higher ethanol fermentation rate from xylose, giving a maximal enhancement in ethanol production of 36.2% compared to the control （untreated）. However, the biomass production of C81015 is lower than that of the control. Analysis of the NADH （nicotinamide adenine dinucleotide）- and NADPH （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）- linked xylose reductases and NAD＋-linked xylitol dehydrogenase indicates that their activities are enhanced by 34.1%, 61.5% and 66.3%, respectively, suggesting that the activities of these three enzymes are responsible for improving ethanol fermentation in C81015 with xylose as a substrate. The results of this study show that DBD air plasma could serve as a novel and effective means of generating microbial strains that can better use xylose for ethanol fermentation.

Candida shehatae的纯化及其利用木糖和葡萄糖发酵的特性研究

通过对休哈塔假丝酵母TZ1分离纯化以获取高产乙醇菌株,并对木糖、葡萄糖以及不同比例的混合糖发酵产乙醇进行实验研究。结果显示,筛选出的TZ8-13对木糖和葡萄糖都有良好的发酵性能,糖浓度为60g/L时的乙醇产量分别达到了21.6g/L和24.2g/L,糖利用率分别为97.81%(72h)和99.13%(36h),较初始菌株TZ1发酵木糖乙醇产量提高了55.38%、木糖利用率提高了19.54%;混合糖发酵存在糖的二次利用关系,TZ8-13首先利用葡萄糖。木糖和葡萄糖比为1:1时乙醇产量为22.8g/L。

假丝酵母Candida sp.木糖发酵生产乙醇

研究了供氧水平、培养基初始pH值、木糖质量浓度等条件对假丝酵母1779A木糖发酵生产乙醇的影响.结果表明:在温度(30℃)、转速(150 r/m in)恒定的条件下,假丝酵母木糖发酵生产乙醇适宜在半好氧条件下进行,乙醇产生的最适初始pH值为5.0,最适木糖质量浓度为60 g/L,最大乙醇转化率为62.1%.假丝酵母木糖发酵生产乙醇存在葡萄糖效应,以葡萄糖与木糖的质量比3∶1混合发酵生产乙醇时的产量比单独木糖发酵生产时的高57.6%.

应用LH与PB设计筛选影响Candida shehatae乙醇产量的无机盐因子

应用空间填充——拉丁超立方(LH)设计与Plackett-Burman设计,研究了无机盐对休哈塔假丝酵母利用木糖产乙醇的影响。以逐步回归与标准最小二乘法对试验结果进行统计分析,从9种无机盐中选出了3个对乙醇产量有显著性影响的因子,即硫酸镁、氯化铁、磷酸二氢钾。

杨木稀酸预处理液木糖发酵产乙醇工艺条件的研究

以1.0%H2SO4在150℃预处理杨木屑20 min可水解溶出66.5%木聚糖和7.1%葡聚糖,生成以木糖为主、含有乙酸和甲酸等发酵抑制物的预处理液,脱毒后可采用Candida shehatae R发酵产乙醇,而Pichia stipitisNL23不能生长。减压蒸发加石灰中和法对预处理液的脱毒效果最佳,可脱除70.0%乙酸和40.0%甲酸,糖损失仅为5.0%－6.0%,C.shehataeR的耗糖率和乙醇得率可达到93.2%和83.6%。采用廉价的无机盐能够满足C.shehataeR发酵脱毒液的营养要求。由于包括乙酸和甲酸以外其它毒性物的抑制,C.shehataeR发酵脱毒液的适宜糖质量浓度为30.0 g/L,发酵12 h,耗糖率和乙醇得率为84.7%和75.3%,乙醇质量浓度达到最高值8.54 g/L,同时生成6.08 g/L木糖醇,C.shehataeR对木糖的利用未受葡萄糖的抑制。

一株高效利用木糖的酵母菌的分离及鉴定

从256个自然试样中筛选到1株高效转化D-木糖为木糖醇的酵母菌株441-28-1。初始木糖质量浓度为90 g/L的条件下,24 h内的木糖利用效率为3.0 g/(L.h)。通过高效液相分析,菌株441-28-1的主要代谢产物为木糖醇。在初始木糖质量浓度为65 g/L的条件下,摇瓶分批发酵,木糖醇生成速率达1.1 g/(L.h),木糖醇转化率为70%。经过形态、生理生化特征测定,以及ITS序列分析(GenBank的登记号为EU121523),将441-28-1菌株鉴定为热带假丝酵母(Candida tropicalis)。Candida tropicalis(热带假丝酵母)已保存于中国高校工业微生物资源数据平台,保藏编号CICIM Y0092。

一株中型假丝酵母发酵木糖产乙醇的特性研究

本研究对自然界中筛选得到的1株可以发酵木糖产乙醇的中型假丝酵母(Candida intermedia)的特性进行了研究。该菌株在28°C、120r/min、72h条件下,发酵3%木糖的乙醇产率最高,达到理论值的43.70%,发酵7%木糖得到的乙醇产量最高,为6.480g/L。发酵时间延长到156h,可以利用8%木糖产乙醇21.225g/L,产率为理论值的72.87%。该菌株还可以在同样条件下,发酵13%葡萄糖得到乙醇50.965g/L,达到理论值的76.90%。以3%+2%+3%分批补加糖,比一次性发酵8%木糖的乙醇产量提高9.91%。在葡萄糖和木糖的混合培养基中,优先利用葡萄糖,同时还表现出葡萄糖对木糖发酵的促进作用,当2%的木糖与6%葡萄糖混合时,乙醇产量比两者单独发酵的加和提高了25%。

代谢工程改善野生酵母利用木糖产乙醇的性能

从256个自然样品中筛选得到1株可高效转化D-木糖的酵母。通过生理生化和分子生物学方法鉴定,证实该菌株是属于Candidat ropicalis。以该酵母为研究对象,增加木糖醇脱氢酶表达量,通过改变代谢流以达到提高酒精产率的目的。以pXY212-XYL2质粒为基础载体,构建了含有潮霉素抗性的pYX212-XYL2-Hygro,电击转化进入野生型C.tropicalis,潮霉素抗性筛选,得到含高拷贝木糖醇脱氢酶基因的重组菌株C.tropicalis XYL2-7。重组菌的比酶活达到0.5u/mgprotein,比原始菌株提高了3倍。实验表明,重组菌木糖醇得率比原始菌株降低了3倍,酒精得率提高了5倍。首次通过实验验证了热带假丝酵母利用木糖产乙醇的可行性,这对研究酵母利用秸秆、麦糠、谷壳等纤维质农业废弃物生产燃料乙醇具有重要启示。

休哈塔假丝酵母发酵木糖生产乙醇的研究

木糖发酵是木质纤维素发酵的关键,休哈塔假丝酵母是自然界木糖发酵性能较好的天然酵母之一。研究了装液量、转速、木糖浓度、有机氮源等条件对休哈塔假丝酵母CICC 1766发酵木糖生产乙醇的影响,探讨休哈塔假丝酵母的乙醇耐受能力。结果表明,休哈塔假丝酵母对酒精的耐受能力达3%vol。在28℃,初始pH值5.0,160r/min,250mL三角瓶装液量150mL,木糖浓度60g/L,玉米浆0.5%(v/v),含尿素0.024%的条件下,休哈塔假丝酵母发酵木糖能产乙醇20.52g/L,得率达到理论值的74.5%。

发酵木糖高产乙醇休哈塔假丝酵母突变株的选育

木糖的乙醇发酵是利用木质纤维原料生产乙醇的关键环节。休哈塔假丝酵母是木糖发酵性能较好的天然酵母之一。研究中对Candida shehatae CICC1766进行了紫外诱变和离子注入诱变,力求选育出发酵木糖产乙醇能力强的假丝酵母。先将其进行紫外诱变,得到的突变株S28在木糖添加量为60g/L的条件下乙醇产量为2364g/L,相比原始菌株提高1498%,乙醇得率达到0394g/g(乙醇/木糖)。再对S28进行氮离子注入诱变,得到的突变株SY58乙醇产量为2508g/L,相比S28提高609%,乙醇得率为0418g/g(乙醇/木糖),达到理论得率的908%。进而对SY58菌株进行了5L罐发酵实验,乙醇产量达到2504g/L,得率为0417g/g(乙醇/木糖),同摇瓶发酵结果基本相同,并且发酵时间由原来的72h缩短到52h。

发酵木糖生产乙醇菌株的筛选与鉴定

从花圃土和腐朽树皮中各筛选得到一株可以发酵木糖产生乙醇的菌株。乙醇产量分别可达到6.98g/L和6.05g/L。经过18SrDNA同源性的分析,菌株3鉴定为间型假丝酵母(Candida intermedia),而菌株621则为热带假丝酵母(Candida tropicalis)。对其发酵木糖、葡萄糖和混合糖的产物蒸馏后用气相色谱分析,主产物为乙醇,纯度高,副产物少。两菌株为下一步的菌种基因改造工作提供了研究基础。

休哈塔假丝酵母发酵木糖制乙醇过程研究

木质纤维素原料水解产物的主要成分是葡萄糖和木糖,其中葡萄糖很容易发酵,致使木糖成为木质纤维素发酵的关键,休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)1766是自然界木糖发酵性能较好的天然酵母之一。研究了发酵温度、发酵时间、接种量、初始pH值、摇床转速等因素对休哈塔假丝酵母1766发酵木糖生产乙醇的影响,由正交试验初步确定了休哈塔假丝酵母发酵木糖制乙醇工艺的适宜条件为好氧条件,发酵时间为2d,发酵温度为28℃,摇床转速为150r/min,初始pH值为5,此时乙醇收率最高可达68.62%。

电融合技术选育能利用木糖和纤维二糖生产乙醇的菌株

以携带营养缺陷型标记的季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii S 208 Arg-）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae 314）为亲本,采用GH-401型电诱导基因转移/细胞融合仪,用3个强度为18kV/cm,时程为10μs,间隔为1s的高压电脉冲处理原生质体,营养互补的融合频率为3.6×10-3。在选择和非选择培养基上连续传代20余次后,对得到的稳定的融合子进行分析比较,结果表明,它们是两亲株融合后形成的融合体。其中有两株融合子能利用木糖和纤维二糖生产乙醇,F-106利用D-木糖（2%）和纤维二糖（2%）生产乙醇的产量分别为3.1g/l和1.05g/l;F-308分别为0.2g/1和2.8g/l。

休哈塔假丝酵母发酵木糖产乙醇的研究

对休哈塔假丝酵母初始菌株经过驯化筛选出一株TZ-8高产酒精菌株，研究了木糖初始浓度、温度、转速以及pH值对TZ-8菌株发酵产乙醇的影响．实验结果表明，最适发酵条件是木糖初始浓度为40g／L，温度为30℃，转速90-110r／min．初始pH4．5～5．0，乙醇产量为11．02g／L．木糖利用率达到86．9％．

休哈塔假丝酵母乙醇发酵性能的研究

木糖的高效发酵是制约纤维素燃料乙醇生产的技术瓶颈之一,高性能发酵菌种的开发是本领域研究的重点。以木糖发酵的典型菌株休哈塔假丝酵母为材料,研究氮源配比、葡萄糖和木糖初始浓度、葡萄糖添加及典型抑制物等因素对其木糖利用和乙醇发酵性能的影响规律。结果表明,硫酸铵更适宜于木糖和葡萄糖发酵产乙醇。在摇瓶振荡发酵条件下,该酵母可发酵164.0 g/L葡萄糖生成61.9 g/L乙醇,糖利用率和乙醇得率分别为99.8%和74.0%;受酵母细胞膜上转运体系的限制,对木糖的最高发酵浓度为120.0 g/L,可生成45.7 g/L乙醇,糖利用率和乙醇得率分别达到94.8%和87.0%。休哈塔假丝酵母发酵木糖的主要产物为乙醇,仅生成微量的木糖醇;添加葡萄糖可促进木糖的利用;休哈塔假丝酵母在葡萄糖发酵时的乙酸和甲酸的耐受浓度分别为8.32和2.55 g/L,木糖发酵时的乙酸和甲酸的耐受浓度分别为6.28和1.15 g/L。

1株热带假丝酵母发酵木糖产乙醇的特性研究

对1株热带假丝酵母Candida tropicalis在不同的发酵条件下发酵木糖产乙醇的特性进行研究。结果表明:溶氧浓度对乙醇的产量和产率有很大影响,适中的溶氧浓度有利于菌体生长和乙醇的积累;较高的起始菌体浓度和尿素添加量对乙醇的生产积累有促进作用;在碳源和氮源充足的情况下,延长发酵时间,乙醇的产量最高达到25.58 g/L的稳定状态,菌体生长也趋于平稳,浓度为6.54×108/mL。

休哈塔假丝酵母HDYXHT-01利用木糖生产乙醇的发酵工艺优化

采用Plackett-Burman(PB)方法和中心组合设计(Central composit design,CCD)对休哈塔假丝酵母Candida shehatae HDYXHT-01利用木糖发酵生产乙醇的工艺进行优化。PB试验设计与分析结果表明:硫酸铵、磷酸二氢钾、酵母粉和接种量是影响木糖乙醇发酵的4个关键因素,以乙醇产量为响应目标,采用CCD和响应面分析法(Response surface methodology,RSM),确定了木糖乙醇发酵的最佳工艺为:硫酸铵1.73 g/L、磷酸二氢钾3.56 g/L、酵母粉2.62 g/L和接种量5.66%,其他发酵条件为:木糖80 g/L,MgSO4.7H2O 0.1 g/L,pH 5.0,培养温度30℃,装液量100 mL/250 mL,摇床转速140 r/min,发酵时间48 h,在该条件下发酵液中乙醇产量可以达到26.18 g/L,是优化前的1.15倍。

热带假丝酵母木糖乙醇发酵相关基因的筛选与分析

以木糖代谢模式菌株热带假丝酵母为材料,采用抑制性消减杂交技术构建高质量的木糖、葡萄糖发酵产乙醇的正向、反向SSH-cDNA文库。采用ABI3730系统测定2个文库中的1 013和525条EST序列,共拼接注释得到正向、反向文库中525个和288个差异性表达的已知基因,另有67个和12个可能的新基因,并对已知基因进行了GO分类。通过文库间BLAST比对去除相似序列,再结合经典代谢理论的指导筛选出候选基因,以实时定量PCR对它们进行了验证和转录本的定量比较分析,最终筛选出与部分木糖代谢和乙醇发酵相关的主效基因,包括STP、HAGT、XR2、XDH1、XDH2和ADH。实验为热带假丝酵母及其他木糖发酵菌株的糖代谢和乙醇发酵的转录谱、基因重组、代谢工程及发酵调控等相关研究提供理论指导。

休哈塔假丝酵母转化木糖和葡萄糖为乙醇的发酵转录谱

【目的】探究木糖发酵典型菌株休哈塔假丝酵母在己糖和戊糖发酵中的转录谱及差异,筛选出与木糖利用和乙醇发酵代谢途径及调控相关的关键性酶和功能蛋白质基因。【方法】应用新一代高通量测序技术454 GS FLX Titanium分别构建了休哈塔假丝酵母木糖、葡萄糖发酵的cDNA文库,并进行De novo转录组的表达序列标签大规模测序和序列比较分析,进而挖掘出该酵母中参与木糖代谢和乙醇发酵的相关基因。【结果】分别对木糖和葡萄糖发酵样本进行二分之一RUN测序并各自得到60万条reads,序列平均长度400 bp。共拼接得到7250条(木糖)和7168条(葡萄糖)contigs,并利用BLAST对木糖样品和葡萄糖样品中的2421个基因(contig)和2456个基因(contig)进行了功能注释和GO分类。通过两个文库间的序列对比分析,共发现158个基因属于差异表达状态(P<0.05)。基于经典的糖酵解及乙醇发酵途径筛选出与木糖乙醇发酵相关的候选基因,并且比较分析其转录水平的差异。【结论】基于大规模转录谱测序和比较分析首次筛选出休哈塔假丝酵母中参与木糖代谢和乙醇发酵的基因群,可为后续的分子生物学及代谢调控研究提供基础数据。

休哈塔假丝酵母中甲酸抑制的目标基因发掘

【目的】探究甲酸对木糖乙醇发酵模式菌株休哈塔假丝酵母基因转录的影响规律,发掘抑制的目标基因及抑制特征。【方法】基于该酵母葡萄糖、木糖代谢转录组的研究成果,结合细胞代谢途径和人工基因比对筛选出乙醇发酵相关基因,再通过RQ-PCR对梯度甲酸抑制条件下的上述基因进行定量分析,进而发掘出甲酸抑制的目标基因。【结果】共筛选出42个相关基因,经RQ-PCR定量分析最终确定受甲酸显著抑制的基因10个,上调基因5个。【结论】在基因转录水平上,休哈塔假丝酵母中甲酸显著抑制的基因按照抑制强度降序排列为XYL2、ACS、RKI、TAL、GND1、TKL、ZWF1、XYL1、PDH和PDC,按照上调强度降序排列为ALD、GLK、MDH、PFK、ADH。