枸杞多糖干预β-淀粉样蛋白1-42诱导SH-SY5Y细胞损伤:线粒体自噬的保护作用

背景:神经退行性疾病与线粒体自噬调节失衡密切相关。课题组前期研究表明枸杞多糖具有神经保护作用,但其能否通过调控线粒体自噬来改善β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤尚不明确。目的:探讨枸杞多糖对β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及机制。方法:通过β-淀粉样蛋白1-42诱导SH-SY5Y细胞建立阿尔茨海默病细胞模型,并用枸杞多糖进行干预。将SH-SY5Y细胞分为3组:对照组,β-淀粉样蛋白1-42组(20μmol/Lβ-淀粉样蛋白1-42干预24 h),枸杞多糖组(先提前1 h加入1 g/L枸杞多糖形成保护作用,然后再加入20μmol/Lβ-淀粉样蛋白1-42与枸杞多糖共同干预24 h)。CCK-8法检测细胞活力;JC-1检测线粒体膜电位;TUNEL染色检测细胞凋亡;免疫荧光和Western blot检测突触、凋亡和线粒体自噬相关指标的表达。结果与结论:①与对照组比较,β-淀粉样蛋白1-42组细胞活力下降(P<0.05),细胞凋亡率上升(P<0.05),线粒体膜电位下降(P<0.05),促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达升高(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P<0.05),突触相关蛋白Syn、PSD-95表达降低(P<0.05),线粒体自噬相关蛋白Pink1、LC3A/B、Parkin、Beclin-1表达降低(P<0.05),P62表达升高(P<0.05);②与β-淀粉样蛋白1-42组比较,枸杞多糖组细胞活力升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05),线粒体膜电位上升(P<0.05),Bax和Caspase-3表达降低(P<0.05),Bcl-2表达升高(P<0.05),Syn和PSD-95表达升高(P<0.05),Pink1、LC3A/B、Parkin、Beclin-1表达升高(P<0.05),P62表达降低(P<0.05)。结果表明:枸杞多糖可能通过调控线粒体自噬来抑制β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤,减少细胞凋亡,增加神经元突触可塑性。

卷曲螺旋结构域蛋白2通过促进线粒体自噬抑制帕金森病SH-SY5Y细胞凋亡

背景:卷曲螺旋结构域蛋白2(coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing 2,CHCHD2)能否调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在帕金森病中发挥神经保护作用尚未可知。目的:探讨CHCHD2在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中对PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬发挥的作用及机制。方法:利用重组质粒转染技术过表达或敲低CHCHD2,用6-羟基多巴胺构建SH-SY5Y细胞帕金森病模型后分对照组、模型组、过表达阴性对照+6-羟基多巴胺组、敲低阴性对照+6-羟基多巴胺组、过表达CHCHD2+6-羟基多巴胺组和敲低CHCHD2+6-羟基多巴胺组。Western blot及RT-qPCR检测CHCHD2的表达;Western blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、MFN1、COXⅣ、DRP1、PINK1、Parkin、TIM23、Bax、Bcl-2及cleavedcaspase3蛋白表达;CCK-8、JC-1和活性氧试剂盒检测细胞活性、线粒体膜电位和活性氧水平,单丹磺酰尸胺染色观察细胞自噬情况,透射电镜观察自噬溶酶体。结果与结论:①与对照组相比,模型组细胞活性、线粒体膜电位及CHCHD2、PINK1、Parkin蛋白表达降低,活性氧水平、凋亡水平及LC3Ⅰ/Ⅱ、p62蛋白表达升高(P<0.05),并观察到自噬溶酶体的存在;②与模型组相比,过表达CHCHD2能降低细胞活性氧水平,升高线粒体膜电位及PINK1、Parkin和MFN1蛋白表达水平,并观察到线粒体自噬溶酶体增多,而敲低CHCHD2后有与上述相反的作用,并伴有COXⅣ、TIM23和p-DRP1蛋白表达的升高(P<0.05);③与模型组相比,过表达CHCHD2能减少细胞凋亡,上调Bcl-2并下调Bax及cleavedcaspase3蛋白的表达,而敲低CHCHD2后有与上述相反的作用(P<0.05);④结果提示,CHCHD2在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中可以通过促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬改善线粒体功能从而减轻细胞凋亡发挥神经保护作用。

灵孢多糖对过氧化氢致SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控

背景:目前研究证实,灵孢多糖可促进神经退行性相关疾病的神经再生。神经退行性疾病的发生与线粒体功能失调密切相关,但灵孢多糖对神经退行性疾病的细胞凋亡及线粒体功能的调控作用尚不明确。目的:探索灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控作用及机制。方法:SH-SY5Y细胞分为3组:对照组,过氧化氢组,灵孢多糖组。对照组细胞正常培养,过氧化氢组细胞用300μmol/L过氧化氢处理24 h,灵孢多糖组先用300μg/μL灵孢多糖干预一两个小时,然后加入300μmol/L过氧化氢干预24 h,干预结束后用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,TUNEL染色试剂盒检测细胞凋亡情况,丙二醛试剂盒和超氧化物歧化酶试剂盒检测丙二醛和超氧化物歧化酶活性,免疫荧光染色法和Western blot法检测凋亡、线粒体动力学相关蛋白的表达。结果与结论:①与对照组相比,过氧化氢组线粒体膜电位和超氧化歧化酶活性显著降低,细胞凋亡率、丙二醇水平显著增高,差异均有显著性意义(P<0.05);与过氧化氢组相比,灵孢多糖组线粒体膜电位和超氧化歧化酶活性显著增高,细胞凋亡率、丙二醛水平显著下降,差异均有显著性意义(P<0.05);②与对照组相比,过氧化氢组促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达显著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降,差异均有显著性意义(P<0.05);与过氧化氢组相比,灵孢多糖组促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著增加,差异均有显著性意义(P<0.05);③与对照组相比,过氧化氢组线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达均显著增高,线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达均显著降低,差异均有显著性意义(P<0.05);与过氧化氢组相比,灵孢多糖组线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达显著降低,线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达显著增高,差异均有显著性意义(P<0.05);④以上结果证实,灵孢多糖可通过改善线粒体功能障碍以减轻过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。

不同浓度阿达帕林诱导SH-SY5Y细胞的分化及凋亡

目的探讨不同浓度阿达帕林对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞形态学及功能的影响,以及诱导细胞分化及凋亡的作用。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组、低浓度(0.1μM和1μM)阿达帕林组、高浓度(10μM)阿达帕林组。采用延时显微拍摄技术观察SH-SY5Y细胞形态学变化,采用免疫荧光染色法检测神经元特异性标志物β-微管蛋白Ⅲ和成熟神经元标志物神经丝重链多肽表达,采用多电极阵列记录SH-SY5Y细胞的电生理特征,细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。结果低浓度阿达帕林促进SH-SY5Y细胞突起形成,突起之间相互连接形成网络;低浓度阿达帕林处理SH-SY5Y细胞可见自发性放电活动。与对照组比较,1μM阿达帕林组SH-SY5Y细胞β-微管蛋白Ⅲ和神经丝重链多肽表达升高,高浓度阿达帕林组细胞凋亡水平升高(P<0.05)。结论低浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y细胞分化为成熟的功能性神经元,高浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y细胞凋亡。

Myod1通过调节lncRNA SNHG15和miR-24-3p对氧糖剥夺SH-SY5Y细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨肌源性分化蛋白1(Myod1)对氧糖剥夺(OGD)诱导的SH-SY5Y细胞增殖抑制和凋亡的影响,并阐明其作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测正常对照组研究对象和缺血性脑梗死组患者外周血及正常培养的SH-SY5Y细胞(对照组)和OGD细胞模型(OGD组)细胞中Myod1和长链非编码RNA(lncRNA)小核仁RNA宿主基因15(SNHG15)mRNA表达水平。分别采用si-Myod1、pcDNA3.0-Myod1、si-SNHG15、pcDNA3.0-SNHG15、si-NC、空载质粒(Vector)、miR-NC和miR-24-3p模拟物(miR-mimics)质粒转染SH-SY5Y细胞后,进行OGD处理,将SH-SY5Y细胞分为对照组、OGD组、OGD+Vector组、OGD+Myod1组、OGD+si-NC组、OGD+si-Myod1组、OGD+si-SNHG15组、OGD+si-SNHG15+Vector组、OGD+si-SNHG15+Myod1组、OGD+miR-NC组、OGD+miR-mimics组、OGD+miR-mimics+Vector组和OGD+miR-mimics+SNHG15组。采用CCK-8法检测各组细胞活性,采用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色法检测各组EdU阳性细胞率,采用原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测各组TUNEL阳性细胞率,采用Western blotting法检测各组细胞中裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved caspase-9)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平。染色质免疫共沉淀(CHIP)法评估Myod1和SNHG15之间的关联。双荧光素酶报告基因实验评估Myod1与SNHG15及SNHG15与miR-24-3p的靶向关系。结果:与正常对照组比较,缺血性脑梗死组患者外周血中Myod1和SNHG15 mRNA表达水平均升高(P<0.05)。与对照组比较,OGD组细胞中Myod1和SNHG15 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05)。与OGD组比较,48和72 h时OGD+Myod1组细胞活性和EdU阳性细胞率均降低(P<0.01),TUNEL阳性细胞率升高(P<0.01);OGD+si-Myod1组细胞活性和EdU阳性细胞率均升高(P<0.01),TUNEL阳性细胞率降低(P<0.01)。Myod1可与SNHG15的启动子序列结合。SNHG15可吸附miR-24-3p,Myod1与SNHG15及SNHG15与miR-24-3p存在靶关系。敲低SNHG15后,与OGD组比较,48和72 h时OGD+si-SNHG15组细胞活性和EdU阳性细胞率均升高(P<0.01),TUNEL阳性细胞率降低(P<0.01),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.01);与OGD+si-SNHG15组比较,48和72 h时OGD+si-SNHG15+Myod1组细胞活性和EdU阳性细胞率降低(P<0.05),TUNEL阳性细胞率升高(P<0.05),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平降低(P<0.05)。过表达miR-24-3p和SNHG15后,与OGD组比较,48和72 h时OGD+miR-mimics组细胞活性和EdU阳性细胞率升高(P<0.01),TUNEL阳性细胞率降低(P<0.01),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.01);与OGD+miR-mimics组比较,48和72 h时OGD+miR-mimics+SNHG15组细胞活性和EdU阳性细胞率降低(P<0.05),TUNEL阳性细胞率升高(P<0.05),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:Myod1可通过与SNHG15启动子区结合进而吸附miRNA-24,促进OGD诱导的SH-SY5Y细胞的增殖抑制和细胞凋亡。

白藜芦醇对H_(2)O_(2)诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的作用

目的研究白藜芦醇(Res)对H_(2)O_(2)诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)氧化损伤的作用。方法选取一定剂量H_(2)O_(2)诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型,通过检测Res对氧化损伤SH-SY5Y细胞的活力影响,筛选后续试验剂量。分别选取20,10,5,1μmol/L Res处理SH-SY5Y细胞24 h,加入1.2 mmol/L H_(2)O_(2),作用24 h,采用MTT法、生长曲线法测定细胞活力,流式细胞术测细胞周期,HE染色观察细胞形态,试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、丙二醛(MDA)含量及细胞外乳酸脱氢酶(LDH)活力。结果1.2 mmol/L的H_(2)O_(2)造成SH-SY5Y细胞氧化损伤,细胞活力降低,细胞周期改变,细胞形态变化,SOD和GSH-Px活力下降,细胞内MDA含量、细胞外LDH活力升高(P<0.01)。与模型组相比,20,10,5μmol/L Res组细胞活力升高,G_(0)/G_(1)期和G_(2)/M期细胞百分率显著升高,S期降低(P<0.01);细胞内SOD和GSH-Px活力上升(P<0.01),MDA含量、细胞外LDH活力明显降低(P<0.01)。结论20,10,5μmol/L Res对H_(2)O_(2)诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤有一定的保护作用。

长链非编码RNA-SNHG15调控缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的研究

讨论长链非编码RNA-SNHG15如何调节SH-SY5Y细胞在缺糖缺氧损伤下的增殖和凋亡。方法 构建缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞模型,通过MTT和AnnexinV/PI等方法分析SNHG15对细胞增殖和凋亡的作用,从而明确SNHG15调控细胞的增殖和凋亡的分子机制。结果 缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞模型组SNHG15表达水平(4.48±0.12)明显高于常氧组(P<0.05);SiNC+OGD组(76.83±2.14)细胞的增值情况明显高于SiRNA+OGD组细胞(F=105.904;P=0.001),而细胞凋亡率则较之明显降低(F=2478.479;P=0.001),且细胞增殖结果为实验两组数据显著低于常氧组,细胞凋亡率结果为两组数据显著高于常氧组;与SiRNA+OGD组比较,SiNC+OGD组的细胞中Bax蛋白的表达显著减少,而Bcl-2和capase-3蛋白的表达则显著增加;与常氧组比较,两组细胞的Bcl-2、capase-3、Bax蛋白的表达均减少(F=80.146、P=0.001;F=3547.563、P=0.001;F=4164.163、P=0.001);P21在常氧组的表达明显低于其他组,SiRNA+OGD组中表达最高。结论 长链非编码RNA-SNHG15在调控缺糖缺氧损伤下的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡中发挥作用。在缺血性脑卒中的兴奋毒性中,P21的表达迅速上调,通过增强促凋亡蛋白Bax的表达,从而诱导caspase3介导的凋亡途径或直接破坏线粒体膜通透性。

松果菊苷对TNFα诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的 探讨肉苁蓉提取物松果菊苷对TNFα诱导的SH SY5Y细胞凋亡的保护作用。方法 用MTT法检测细胞存活率,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测细胞凋亡的发生,以激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化,并用荧光酶标仪测定caspase 3的活性。结果 100μg·L-1 TNFα处理细胞 36h显著降低细胞的存活率;诱导细胞发生凋亡,凋亡率达37%;细胞内活性氧水平及caspase 3的活性升高;而线粒体膜电位却明显降低,红 /绿荧光强度的比值由正常的 5 97降低为 0 35左右。而预先给予 1, 10或者 100mg·L-1浓度的松果菊苷处理细胞 2h,可提高细胞存活率;并可有效抑制DNAladder的发生;流式细胞仪检测凋亡率分别降低到25 9%, 18 3% 和 8 2%;激光共聚焦显微镜结果显示松果菊苷可明显抑制细胞内活性氧产生;并可逐渐恢复线粒体的高能量状态;caspase 3的活性不断降低,并呈现了一定的剂量依赖性。结论 松果菊苷能抑制TNFα诱导的SH SY5Y细胞凋亡,其神经细胞保护作用可能与降低细胞内活性氧水平,抑制caspase 3的活性和维持线粒体膜电位的高能状态有关。

红景天甙对缺氧/缺糖损伤的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响

目的 :观察红景天甙对SH -SY5Y细胞缺氧 /缺糖损伤时细胞内 [Ca2 + ]i、细胞凋亡率、细胞线粒体膜电位和活性的变化 ,探讨其对神经细胞线粒体膜电位的影响。方法 :应用细胞培养 ,四唑盐比色实验 (MTT )检测细胞线粒体活性 ,流式细胞术检测细胞内 [Ca2 + ]i、细胞凋亡百分率和线粒体膜电位。结果 :SH -SY5Y细胞缺氧 /缺糖损伤 2、4、6、12h后 ,细胞内 [Ca2 + ]i和细胞凋亡百分率明显高于对照组 ,均有显著差异 (P <0 0 1) ;细胞经缺氧 /缺糖处理后 ,线粒体膜电位和活性明显低于对照组 ,2h时分别为 2 9 17% (P <0 0 1) ,38 80 % (P <0 0 1) ,12h时分别为5 6 72 % (P <0 0 1) ,6 3 5 8% (P <0 0 1) ;红景天甙能显著降低细胞内 [Ca2 + ]i,抑制细胞凋亡的发生 ,提高线粒体膜电位和活性 ,与缺氧 /缺糖损伤组相比均有显著差异 (P <0 0 5 ,P <0 0 1)。结论 :红景天甙可抑制缺氧 /缺糖损伤所致的线粒体膜电位和活性的降低 ,从而具有稳定线粒体膜电位的作用 ,抑制细胞凋亡的发生 。

大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用

目的评价大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用。方法小鼠淋巴瘤细胞在代谢活化或非代谢活化条件下暴露于50、200、350、500μg/mL大黄酸3 h,处理后第2天将细胞接种于含有突变选择剂三氟胸苷的96孔板中,计数各剂量组的突变细胞集落数。通过计算第0天的相对存活率(relative survival,RS)、相对悬浮增长率(relative suspension growth,RSG)和相对总增长率(relative total growth,RTG)确定细胞毒性。用MUTANT软件包计算各种细胞毒性参数和突变率,并对突变率数据进行统计分析。结果在非代谢活化条件下,50、200、350、500μg/mL的大黄酸均未见诱导L5178Y细胞的突变率增加,阳性对照组诱导的突变率显著增加;在代谢活化条件下,大黄酸350μg/mL剂量组诱导L5178Y细胞的突变率增加,阳性对照组诱导的突变率显著增加。结论在非代谢活化条件下大黄酸各剂量组对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因无致突变作用;在肝微粒体酶系S9代谢活化条件下,出现了弱致突变性。

黄芪甲苷通过调控线粒体功能抑制H_(2)O_(2)诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

目的:探讨黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AST Ⅳ)对由氧化应激损伤引起的线粒体功能障碍以及细胞凋亡的作用及机制。方法:体外培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,用过氧化氢(hydrogen peroxide,HO)诱导建立氧化应激模型,分为PBS组、模型组(HO组)和HO+AST Ⅳ组。应用ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平;用线粒体膜电位检测试剂盒JC-1检测细胞线粒体膜电位变化;应用Western blot法检测线粒体呼吸链上的complex Ⅰ~Ⅴ,分别为NADH:泛醌氧化还原酶亚基B8(NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit B8,NDUFB8;complex Ⅰ)、琥珀酸脱氢酶B(succinate dehydrogenase B,SDHB;complex Ⅱ)、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2(ubiquinol-cytochrome C reductase core protein 2,UQCRC2;complex Ⅲ)、细胞色素C氧化酶Ⅰ(mitochondrially encoded cytochrome C oxidase Ⅰ,MTCO1;complex Ⅳ)和ATP合酶F1亚基α(ATP synthase F1 subunit alpha,ATP5A;complex Ⅴ),检测线粒体动力学分裂蛋白——磷酸化发动蛋白相关蛋白1(phosporylated dynamin-related protein 1,p-Drp1)和线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1,Fis1),以及融合蛋白——线粒体融合蛋白1(mitofusin 1,Mfn1)、Mfn2和视神经萎缩症蛋白1(optic atrophy protein 1,OPA1),检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3;采用免疫荧光染色法检测NDUFB8和MTCO1表达;采用TUNEL染色检测细胞凋亡。结果:在200μmol/L H_(2)O_(2)诱导的SY5Y细胞氧化应激模型中,线粒体膜电位(P<0.01)和ATP水平(P<0.05)显著下调,呼吸链氧化磷酸化过程中NDUFB8、SDHB、ATP5A和MTCO1的表达均显著减少(P<0.05或P<0.01),线粒体分裂蛋白Fis1(P<0.05)和p-Drp1(P<0.01)蛋白水平显著升高,融合蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1表达则显著降低(P<0.05或P<0.01),促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达量显著降低(P<0.01)。AST Ⅳ能够显著提高细胞线粒体膜电位(P<0.01)和ATP水平(P<0.01),显著促进呼吸链氧化磷酸化过程中NDUFB8、SDHB、MTCO1、ATP5A及UQCRC2的表达(P<0.05或P<0.01),显著降低p-Drp1和Fis1蛋白水平(P<0.01),显著增加OPA1、Mfn1和Mfn2的表达(P<0.05或P<0.01),显著增加Bcl-2表达(P<0.05),显著降低Bax和cleaved caspase-3蛋白水平(P<0.01)。结论:AST Ⅳ能够保护神经元,其可能的机制是通过改善线粒体功能,调控线粒体动力学分裂/融合平衡,从而减轻氧化应激损伤导致的神经元凋亡。

毛蕊花苷对MPP^+诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用

目的观察肉苁蓉提取物毛蕊花苷对MPP+诱导的SHSY5Y细胞损伤的影响。方法用MTT法检测细胞存活率,以流式细胞仪检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化,以及细胞凋亡的发生,并用荧光酶标仪测定caspase-3的活性,蛋白印迹测定Bcl-2的表达水平。结果200μmol·L-1MPP+处理细胞24h降低细胞的存活率;诱导细胞发生凋亡,凋亡率达38.9%;细胞内活性氧水平及caspase-3的活性升高;而线粒体膜电位却明显降低。而预先给予0.1、1或者10mg·L-1浓度的毛蕊花苷处理细胞12h,可提高细胞存活率;流式细胞仪检测凋亡率分别降低到29.5%,15.3%和8.6%,而且细胞内活性氧的水平明显降低,并可逐渐恢复线粒体的高能量状态;caspase-3的活性不断降低,Bcl-2的表达水平增高,并呈现一定的剂量依赖性。结论毛蕊花苷能抑制MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡,其神经细胞保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平,维持线粒体膜电位的高能状态和抑制caspase-3的活性有关。

五味子乙素对谷氨酸诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及其机制

目的:探讨五味子乙素(SchB)对谷氨酸(Glu)致人神经母瘤细胞SH-SY5Y细胞损伤的保护作用,阐明其对ATR信号通路的影响。方法:将处于对数生长期的SH-SY5Y细胞分为对照组、DMSO组、模型组、SchB1组、SchB2组和SchB3组。对照组SH-SY5Y细胞不做任何处理;DMSO组SH-SY5Y细胞用17mmol·L^(-1) DMSO作用24h;模型组SH-SY5Y细胞用20 mmol·L^(-1) Glu孵育24h造成细胞损伤模型;SchB1、SchB2和SchB3组采用0.05、0.10和1.00μmol·L^(-1)浓度SchB预处理SH-SY5Y细胞24h后再用Glu(20mmol·L^(-1))继续孵育24h。MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blotting法检测ATR、p-CHK1、p-Cdc25c和P53蛋白表达情况。结果:MTT法检测,与模型组比较,SchB1、SchB2和SchB3组细胞存活率明显升高(P<0.05或P<0.01),且SchB2组细胞存活率最高,故选取SchB2组作为SchB组进行后续实验。细胞周期检测,与对照组比较,模型组G0/G1期细胞所占百分比降低(P<0.05),S期和G2/M期细胞所占百分比升高(P<0.05);与模型组比较,SchB组G0/G1期细胞所占百分比升高(P<0.05),S期和G2/M期细胞所占百分比降低(P<0.05)。Western blotting法检测,与对照组比较,模型组细胞中ATR、p-CHK1、p-Cdc25c和P53蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,SchB组细胞中ATR、p-CHK1、p-Cdc25c和P53蛋白表达水平均降低(P<0.05)。结论:SchB对Glu致SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用,其机制可能与下调ATR信号通路、减少细胞周期阻滞有关。

美洲大蠊油脂对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用

采用人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞,建立过氧化氢(H2O2)诱导的氧化损伤模型,加入H2O2前用美洲大蠊油脂(100、200、400、800、1000μg/m L)预处理,通过MTS法检测细胞存活率,比色法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,相关试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)系列抗氧化酶的活性,以及脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量的变化,从细胞水平研究美洲大蠊油脂对氧化损伤细胞的保护作用,并初步探讨其作用机制。实验结果显示,与对照组相比,模型组细胞存活率明显降低,LDH漏出率明显增加,胞内SOD、GSH-Px活性显著降低,MDA含量增多。与模型组相比,美洲大蠊油脂(800、1000μg/m L)能显著增强细胞SOD(P<0.01)、GSH-Px(P<0.05)活性,降低MDA含量(P<0.05),使得细胞存活率显著提高(P<0.01),LDH漏出率降低(P<0.01)。其中油脂的浓度与细胞存活率、SOD活性之间为正相关,与MDA含量为负相关,均呈现浓度依赖性。结果提示美洲大蠊油脂对H2O2所致SH-SY5Y细胞氧化损伤具有明显的保护作用,其作用机制可能与提高细胞SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量从而增强细胞自身抗氧化能力有关。

针刺通过颅脑损伤大鼠血清对SY5Y细胞内钙离子浓度的影响

目的:研究针刺通过颅脑损伤大鼠血清对SY5Y细胞内钙离子[Ca2+]i的影响。方法:采用激光共聚焦显微镜的动态扫描功能和荧光分子探针技术,从针灸血清学和细胞学角度,对针刺通过颅脑损伤大鼠血清对SY5Y细胞[Ca2+]i的影响进行研究。结果:各组血清孕育后SY5Y细胞[Ca2+]i相比较显示,模型对照组的荧光强度明显高于空白对照组(P<0.01),而针刺治疗组的荧光强度虽然也高于空白对照组(6h组除外),但明显低于模型对照组(P<0.01)。结论:颅脑损伤大鼠的血清可使SY5Y细胞[Ca2+]i升高,针刺可以通过血清减缓此过程的发生。

羟基红花黄色素A对MPP^+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的观察羟基红花黄色素A(HSYA)对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用,并探讨其作用机制。方法采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率;二乙酸二氯荧光素盐(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(ROS)含量;罗丹明123(Rhodamine123)染色法检测细胞线粒体膜电位;Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达。结果 1mmol/L MPP+处理SH-SY5Y细胞48h后,细胞存活率显著降低,并诱导细胞产生凋亡,凋亡率达(38.6±1.8)%。而HSYA(15、60、120μmol/L)预处理1h,可明显增加SH-SY5Y细胞存活率(P<0.001),并能有效抑制MPP+诱导的细胞调亡(P<0.01);可明显抑制MPP+诱导的细胞内ROS的增加(P<0.001);也能有效抑制MPP+诱导的细胞线粒体膜电位的降低(P<0.01)。120μmol/L HSYA预处理能显著性增加Bcl-2/Bax比值(P<0.01);能够明显抑制MPP+诱导的胞质Cyt-C的释放(P<0.05)和Caspase-3、Caspase-9的高表达(P<0.05,P<0.05)。结论 HSYA预处理能明显提高MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的细胞存活率,可有效抑制细胞调亡的发生,其机制可能与抑制细胞线粒体凋亡途径有关。

SH－SY5Y细胞胞内钙库特性研究

运用单细胞显微荧光测量技术测量了单个ＳＨ—ＳＹ５Ｙ细胞内游离钙离子浓度的变化。首次报道了ＳＨ—ＳＹ５Ｙ细胞内存在毒蕈碱敏感而非咖啡因敏感的钙库，并研究了它的动力学特征。Ｎ￣￣Ｃ￣ｈｅｔｗＭａｄＵｇｈ＊ＴＯｗｈｏｍＣｂ￣ｐｏｎｄｅｎｅｅｓｈｏｕｌｄｂｅ￣．

人参水提物对β淀粉样蛋白诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的研究人参水提物(water extracts of Ginseng,WEG)对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用。方法用Aβ25-35诱导体外培养的SH-SY5Y细胞凋亡,并用WEG进行保护。MTT法检测细胞存活率,Hoechst33258染色观察细胞形态的变化,流式细胞仪分析亚二倍体峰和DNA含量,检测细胞凋亡。结果Aβ25-3550μmol/L诱导SH-SY5Y细胞72 h后,镜下观察到细胞变圆,损伤并聚集,Hoechst33258染色可见明显的颗粒状和固缩状荧光,流式细胞仪检测到明显的亚二倍体峰,凋亡率达(37.30±0.69)%。而Aβ25-35和不同浓度的WEG(1,5,10,15 mg/ml)同时处理后,细胞形态明显改善,MTT值显著高于Aβ25-35处理组(P<0.01),流式细胞仪检测凋亡率分别降低到(14.70±3.18)%,(7.23±1.51)%,(6.14±0.40)%,(5.88±1.33)%,呈现剂量依赖关系。结论人参水提物对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡有显著的保护作用。

西洋参水提物对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的:探究在以SH-SY5Y细胞作为神经元代表,β淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导凋亡的阿尔茨海默症(Alzheimer′s Disease,AD)体外细胞模型中,西洋参水提物(water extracts of American Ginseng,WEAG)对神经元的保护作用。方法:流式细胞仪(FCM)检测确定Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的最佳浓度和时间,以及WEAG抗凋亡的浓度,MTT法检测细胞存活率,Hoechst33258染色观察细胞形态的变化。结果:50μmol/L Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞72 h后,细胞变圆,聚集,Hoechst33258染色可见明显的颗粒状和固缩状荧光,FCM检测凋亡率达(37.30±0.69)%,与对照组(1.56±0.80)%比较,差异具有显著性意义(P<0.05)。而Aβ25-35和不同浓度的WEAG(0.5、1、5 mg/ml)同时孵育后,细胞形态明显改善,MTT值显著高于Aβ25-35处理组(P<0.01),凋亡率分别降低到(16.71±1.08)%、(10.52±2.11)%和(3.39±1.65)%,与Aβ25-35损伤组(37.30±0.69)%相比,差异具有统计学意义(p<0.05),并呈现出剂量依赖关系。结论:西洋参水提物对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡有显著的保护作用。

Aβ25-35对SH-SY5Y细胞Bcl-2、Bax基因启动子区DNA甲基化的影响

目的探讨Aβ_(25-35)介导SH-SY5Y细胞Bcl-2、Bax基因表达改变是否通过基因启动子区甲基化的机制。方法不同浓度Aβ_(25-35)(0、25、50μmol·L^(-1))分别作用于体外培养的SH-SY5Y细胞48、72 h,MTT法确定Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞凋亡的最佳浓度和时间。Western blot检测不同药物处理组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达变化,Real time PCR检测DNA甲基化酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、Me CP2的mRNA水平。Methylation specific PCR(MSP)法分析Aβ_(25-35)介导的Bcl-2、Bax基因启动子区甲基化水平的变化。结果 25μmol·L^(-1)Aβ_(25-35)暴露SH-SY5Y细胞72 h后,MTT检测细胞存活率达(68.49±9.83)%,与对照组比较明显降低(P<0.05),表明成功建立了AD细胞凋亡模型。Western blot结果显示,Aβ_(25-35)药物处理组与空白组比较,Bcl-2表达明显减少,Bax表达明显增加。Real-time PCR结果显示,不同浓度的Aβ_(25-35)药物组与空白组比较,DNA甲基化酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MeC P2表达无变化(P<0.05);MSP结果显示空白对照组Bcl-2和Bax甲基化扩增阴性,非甲基化扩增阳性;Aβ_(25-35)处理组Bcl-2和Bax甲基化引物扩增阴性,非甲基化引物扩增阳性。结论 MSP结果显示Aβ_(25-35)介导SHSY5Y细胞凋亡未引起Bcl-2、Bax启动子区甲基化的改变。