神经肽Y/Y1受体激活β⁃catenin信号通路介导心肌细胞损伤

目的:研究神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)/Y1受体信号转导在心肌细胞损伤中的作用及机制。方法:C57BL/6J小鼠皮下注射异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)构建心肌损伤模型,腹腔注射Y1受体特异性拮抗剂BIBO3304干预。小鼠随机分为对照组(生理盐水)、ISO组[20 mg/(kg·d)ISO]、BIBO3304+ISO组[0.1 mg/(kg·d)BIBO3304+20 mg/(kg·d)ISO]、BIBO3304组[0.1 mg/(kg·d)BIBO3304],每组10只,连续给药14 d。实时定量PCR和Western blot检测小鼠心肌组织中NPY表达。HE染色和Masson染色观察各组小鼠心肌纤维结构变化和纤维化程度;定量PCR检测小鼠心肌肥大基因心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、β⁃肌球蛋白重链(β⁃myosin heavy chain,β⁃MHC)mRNA表达。采用Y1受体特异性激活剂[Leu31,Pro34]⁃NPY刺激H9C2细胞,检测ANP、β⁃MHC mRNA表达;CCK⁃8检测心肌细胞活力。Western blot检测各组小鼠心肌组织和H9C2细胞中activeβ⁃catenin、磷酸化糖原合成酶激酶⁃3β(phospho⁃glycogen synthesis kinase 3β,p⁃GSK3β)、总糖原合成酶激酶⁃3β(total glyco⁃gen synthesis kinase 3β,t⁃GSK3β)蛋白表达。免疫荧光染色检测心肌细胞β⁃catenin入核情况。利用β⁃catenin特异性抑制剂ICG001处理细胞,检测[Leu31,Pro34]⁃NPY诱导的心肌细胞肥大和细胞活力变化。结果:与对照组比较,ISO组小鼠心肌组织NPY mRNA和蛋白表达均显著增加(P<0.05),心肌纤维排列紊乱,心肌纤维化程度高,心肌肥大基因表达增加。与ISO组比较,BIBO3304+ISO组小鼠心肌损伤和纤维化得到有效缓解,心肌肥大基因表达下降(P<0.01)。与对照组比较,[Leu31,Pro34]⁃NPY增加H9C2细胞ANP、β⁃MHC mRNA表达,降低心肌细胞活力(P<0.01)。与对照组比较,ISO组小鼠心肌组织activeβ⁃catenin、p⁃GSK3β表达明显上调,p⁃GSK3β/t⁃GSK3β增加;与ISO组比较,BIBO3304+ISO组心肌组织activeβ⁃catenin、p⁃GSK3β表达降低(P<0.05)。与对照组比较,[Leu31,Pro34]⁃NPY显著增加心肌细胞activeβ⁃catenin、p⁃GSK3β表达(P<0.05),促进细胞核β⁃catenin积累。与[Leu31,Pro34]⁃NPY组比较,BIBO3304抑制细胞核β⁃catenin表达,ICG001显著缓解[Leu31,Pro34]⁃NPY诱导的心肌细胞肥大和细胞活力下降(P<0.01)。结论:NPY通过Y1受体转导激活β⁃catenin信号通路介导心肌细胞损伤和心肌纤维化。

神经肽YY1受体拮抗剂促进大鼠BMSCs成骨分化和股骨缺损修复

目的探索神经肽Y Y1受体拮抗剂(PD160170)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化以及骨缺损修复的影响。方法第三代大鼠BMSCs成骨分化诱导培养,随机分为4组,对照组(等体积PBS),终浓度分别为10^(-6)、10^(-7)、10^(-8)mol/L Y1受体拮抗剂三浓度梯度组,在干预7、14 d时,分别进行碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色;在干预7、21 d时,采用q-PCR和Westen blot检测I型胶原(COLI)、骨钙素(OCN)和Runt相关转录因子2(Runx2)基因和蛋白的表达。采用300±20 g雄性SD大鼠构建股骨髁上骨缺损模型,直径为2.5 mm,随机分为3组,每组6只,分别每日局部注射0.2 m L溶液等体积PBS(对照组)、10^(-6)mol/L和10^(-8)mol/L Y1受体拮抗剂溶液,28 d后处死,Micro-CT检测观察骨缺损修复情况。结果 ALP和茜素红染色发现,Y1受体拮抗剂组细胞胞浆内棕色颗粒、细胞外周基质矿化结节均高于对照组,且具有浓度特异性,以10^(-8)mol/L最为明显;q-PCR及Westem blot检测发现,在成骨分化诱导第7天,10^(-8)mol/L Y1受体拮抗剂组COLI m RNA和蛋白表达水平均显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);在第21天,10^(-8)mol/L Y1受体拮抗剂组OCN、Runx2 m RNA和蛋白表达明显高于对照组(P<0.05)。通过micro-CT分析发现,在局部注射10^(-6)Y1受体拮抗剂28 d后,骨缺损BV/TV、骨密度、骨小梁数量高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05);而骨小梁厚度(P=0.07)、骨体积(P=0.35)在各组之间差异无统计学意义。结论神经肽Y Y1受体拮抗剂可促进BMSCs成骨分化以及骨缺损的修复,提示阻断Y1受体信号传导具有预防或治疗骨折、骨质疏松症等潜力,为临床药物研究提供一定的实验依据。

大鼠心脏中神经肽Y的Y1受体样免疫反应物质的定位

目的 为在细胞水平精确地确定神经肽 Y(NPY)的Y1 受体样免疫反应物质 (- L I)在大鼠心脏中的分布 .方法 用免疫组织化学方法对 Y1 受体 - L I细胞进行了检测 .结果 1一些心肌细胞含有 Y1 受体 - L I,可见清晰的 Y1 受体免疫反应性 (- Ir)条纹 ,此类细胞在心脏呈斑点状分布 ,接近外膜侧和室间隔的内膜侧分布较多 ,Y1 受体 - L I主要分布于心肌细胞膜、横小管膜和小泡上 ;2心脏内有 Y1 受体 - L I的心内神经元 ,此类细胞有较长的突起 ,呈离散分布 ,与 Y1 受体 - L I心肌细胞或血管相邻 ,Y1 受体 - L I神经元的外膜和胞质内有较强的 Y1 受体 - L I,尤以其突起明显 .结论 NPY对心脏作用的复杂性可能与 Y1

神经肽Y及其Y1受体在遗传性癫痫大鼠脑内的表达及意义

目的探讨遗传性癫痫大鼠(TRM)海马和颞叶皮质中神经肽Y(NPY)及其Y1受体(Y1R)的表达和分布。方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测NPY和Y1R m RNA表达。ELISA试剂盒法检测TRM和Wistar大鼠海马和颞叶皮质中NPY浓度。Western blot检测Y1R蛋白表达。免疫荧光双标记法分析TRM及Wistar大鼠海马CA1、CA3和DG区以及颞叶皮质中NPY与Y1R的分布和共定位。结果 ELISA和RT-PCR结果均显示,TRM海马和颞叶皮质中NPY表达明显上调,与Wistar大鼠比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果证实,TRM海马中Y1R蛋白表达明显低于Wistar大鼠,而在颞叶皮质中显著高于Wistar大鼠。免疫荧光分析发现NPY与Y1R在TRM海马CA1、CA3区神经元细胞和DG区颗粒细胞以及颞叶皮质神经元细胞中分布广泛,并存在共定位且主要定位在细胞膜上。结论在TRM海马和颞叶皮质中,NPY及其Y1R表达出现异常变化,而这种异常表达可能与TRM癫痫发生机制有关。

神经肽Y1受体激动药诱导大鼠心肌细胞肥大的研究

目的探讨神经肽Y1受体激动药[Leu31,Pro34]NPY在诱导心肌细胞肥大中的作用。方法用不同浓度[Leu31,Pro34]NPY刺激原代培养心肌细胞,采用放射性核素3H-leu掺入法检测培养心肌细胞蛋白质合成速率。应用荧光定量PCR方法检测[Leu31,Pro34]NPY对培养心肌细胞肥大相关基因ANF、β-MHCmRNA表达的影响。结果[Leu31,Pro34]NPY(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L)作用心肌细胞24h后可明显增加心肌细胞3H-leu的掺入量(P<0.01),并可诱导心肌细胞β-MHC表达增加(P<0.01),对ANF表达的影响不明显。结论神经肽Y1受体激动药[Leu31,Pro34]NPY可加快细胞蛋白质合成速率、促进心肌细胞β-MHC表达,直接诱导心肌细胞的肥大。

三叉神经痛模型大鼠三叉神经节中P2Y1受体的时序表达分析

目的:探讨P2Y1受体在三叉神经痛大鼠三叉神经节神经元内的时序表达。方法:雄性SD大鼠68只,随机分成3组。正常对照组(4只)未做任何处理;假手术组(32只)暴露眶下神经但不做结扎;手术组(32只)暴露眶下神经并结扎右侧。假手术组和手术组按照术后各时间点(每时间点4只)取出三叉神经节。行为学观察、HE染色评价动物模型,免疫组化检测并分析TG中P2Y1受体的表达情况。结果:正常对照组中P2Y1受体在TG神经元中表达较弱。手术侧各时间点P2Y1受体的表达均增加。手术侧与假手术组各时间点的P2Y1受体表达量变化存在差异。手术侧P2Y1受体的表达先增加后逐渐回落,手术侧该受体各时间点的表达量均高于假手术组。手术侧与手术对侧各时间点的P2Y1受体表达量变化差异较小。结论:P2Y1受体在CCI-ION模型大鼠的TG神经元内的表达出现不同程度的波动,可能在神经痛中具有一定的作用,且手术侧的痛觉神经传导对对侧TG产生了影响。

P2Y1受体介导星形胶质细胞的激活在急性一氧化碳中毒迟发性脑病中的作用

目的探讨P2Y1受体和星形胶质细胞在急性一氧化碳(CO)中毒迟发性脑病(DEACMP)中的作用以及DEACMP可能的发病机制。方法经水迷宫实验筛选认知功能合格的雄性SD大鼠,随机分为两组:对照组、CO中毒组,CO中毒组制作DEACMP模型,分别于造模后第7天、第14天、第21天、第28天对比两组行为学改变,神经元变化以及海马组织中P2Y1受体和星型胶质细胞的表达。结果通过水迷宫发现与对照组相比,造模后第21天、第28天CO中毒组大鼠逃避潜伏期均明显延长(P<0.05);HE染色发现造模后第14天、第21天、第28天模型组大鼠海马锥体细胞及神经元坏死明显,结合水迷宫可表明大鼠在21 d时出现DEACMP;与对照组相比,Western blot法检测提示各时间点CO中毒组海马区P2Y1及GFAP蛋白表达均增多(P<0.05),呈先升高后降低的趋势;免疫荧光表明海马区P2Y1和GFAP存在共表达,相对于对照组,中毒后各时间点海马CA 1区P2Y1和GFAP都有表达上调(P<0.05)。结论P2Y1受体对星形胶质细胞的激活可能是DEACMP的发病机制之一,星形胶质细胞可能通过介导免疫炎症反应使CO中毒的大鼠学习记忆能力损害导致DEACMP发生。

慢性低灌注脑组织中NPY1受体mRNA的表达

目的:研究低灌注状态脑组织神经肽Y1受体的mRNA表达。方法:建立左侧颈外静脉与颈总动脉端侧吻合的大鼠模型,测定吻合形成后脑血流动力学及脑组织神经肽Y(NPY)改变,检测该组织NPY1R mRNA表达。结果:大鼠静脉动脉端侧吻合形成动静脉分流,左侧局部脑血流量显著降低,脑组织中NPY增加,NPY1R mRNA表达下降。吻合口阻断后,左侧大脑血流量显著增加,NPY1R mRNA表达进一步减低。结论:长期低灌注脑缺血后NPY1R减少,使脑血管自动调节功能下降导致“正常灌注压突破”。

P2Y1受体基因在先天性巨结肠中的表达及其意义

目的探讨嘌呤P2Y1受体与先天性巨结肠(HD)发病的关系。方法选取郑州大学第三附属医院小儿外科20例HD患儿手术切除结肠的狭窄段和扩张段全层组织。20例HD患儿均根据临床症状、体征、钡灌肠、术中所见及病理检查证实为HD。男13例,女7例;手术年龄为10 d^2岁,平均4个月。常见型13例,长段型5例,短段型2例。另取20例直肠黏膜脱垂切除的正常结肠组织作为对照。采用反转录(RT)-PCR检测P2Y1受体基因在所取标本中的表达。结果 P2Y1受体基因在HD狭窄段肠管全层无表达(表达阳性率为0),其在HD扩张段表达减少(阳性率为45%),在正常肠管组织正常表达(阳性率为86.5%)。P2Y1受体基因在狭窄段表达水平与其在扩张段和正常结肠组织的表达水平差异均有统计学意义(Pa=0.000);P2Y1受体基因在HD扩张段肠管表达水平与其在正常肠管表达水平比较差异无统计学意义(P=0.914)。结论 P2Y1受体基因在结肠中表达缺乏可能是HD发病的重要原因之一,同时也是肠动力障碍的一个重要原因。

重组人神经肽Y受体Y1融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的在大肠杆菌中表达人神经肽YY1受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定,表达产物包涵体经Ni2+-NTA亲和层析纯化。然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y1受体蛋白。结果经IPTG诱导含有pET28a-Y1重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y1融合蛋白。重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白。经相关在线软件分析后获得了Y1受体的相关生物学特性。结论重组质粒pET28a-Y1在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y1受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础。

地塞米松抑制星形胶质细胞P2Y_1受体表达及TNF-α分泌

目的观察不同浓度地塞米松对大鼠体外培养脊髓背角星形胶质细胞P2Y1受体表达及TNF-α分泌的影响。方法培养并纯化大鼠脊髓背角星形胶质细胞,地塞米松(终浓度分别为0.1、1、10μmol/L)处理24 h后,采用免疫组织化学染色观察P2Y1受体的表达,双抗夹心间接酶联免疫吸附法测定上清液中TNF-α含量。结果地塞米松(0.1、1、10μmol/L)作用24 h后,与对照组比较,脊髓背角星形胶质细胞P2Y1受体表达下调,并呈剂量依赖性(P<0.01),TNF-α分泌量亦呈剂量依赖性下降(P<0.01)。结论地塞米松能抑制体外培养大鼠脊髓背角星形胶质细胞P2Y1受体表达及TNF-α的分泌。

大鼠脑血管内皮细胞中神经肽Y的Y_1受体

目的 对脑血管内皮细胞中神经肽 Y(NPY)的 Y1 受体进行精确定位 .方法 用针对 NPY的 Y1 受体 C末端肽片段的一种纯化的抗血清 ,用免疫组织化学方法和包埋前免疫金 -银加强法观察 Y1 受体在脑血管内皮细胞中的分布 .结果 大脑皮质和髓质、丘脑、下丘脑、小脑和脑干的微血管有散在的含 Y1 受体免疫反应的 (- Ir)内皮细胞 ,孤立的脑底动脉及其分支的一些内皮细胞也具有 Y1 受体免疫反应性 (- L I) ,Y1 受体 - L I分布于内皮细胞的血管腔面和平滑肌细胞面的细胞膜和胞质中 .结论 来源于血液、内皮细胞和血管周围神经的 NPY通过内皮细胞上 Y1 受体的介导 。

神经肽YY_1受体样免疫反应物质在大鼠冠状血管中的分布

目的 对大鼠冠状血管中神经肽 Y(NPY)的 Y1 受体样免疫反应物质 (- L I)进行定位 .方法 用免疫组织化学方法在光镜和电镜水平进行观察 .结果 大鼠心脏内大的冠状动脉未见 Y1 受体免疫反应的 (- Ir)标记 ,小动脉和微动脉的多数平滑肌细胞则含 Y1 受体 - L I.小动脉和微动脉平滑肌细胞的 Y1 受体 - L I在血管外膜侧、内皮细胞侧和两个平滑肌细胞相邻侧的细胞膜上均有散在的 Y1 受体 - L I和 Y1 受体 - Ir小泡 ,一些毛细血管的内皮细胞呈 Y1 受体 - L I.结论 NPY对冠状血流的调节主要作用于小动脉和微动脉的平滑肌细胞 ,有些毛细血管的内皮细胞可能也参与 NPY对血流的调节 .

ATP通过P2Y_1受体引发脊髓背角星形胶质细胞[Ca^(2+)]i升高和GFAP表达上调

目的观察体外培养的背角星形胶质细胞P2Y1受体激活对其[Ca2+]i的变化和GFAP表达的影响。方法培养并纯化脊髓背角星形胶质细胞,采用免疫组织化学染色观察背角星形胶质细胞P2Y1受体及GFAP的表达,激光共聚焦技术观察星形胶质细胞[Ca2+]i的变化。结果体外培养的大鼠脊髓背角星形胶质细胞大多表达P2Y1受体;P2Y受体激动剂ATP、ADP、ADP-βs剂量依赖性促进星形胶质细胞[Ca2+]i升高;10μmol/L的ATP、ADP和ADP-βs显著增加胞内[Ca2+]i,此作用可被特异性P2Y1受体拮抗剂MRS2179所阻断,并具量效关系。免疫组织化学染色结果显示,100μmol/L的ATP、ADP和ADP-βs作用下,星形胶质细胞GFAP表达上升,此效应可被100μmol/L的MRS2179所抑制。结论体外培养的大鼠脊髓背角星形胶质细胞表达P2Y1受体;P2Y1受体介导了ATP、ADP及ADP-βs促进星形胶质细胞[Ca2+]i升高和GFAP表达增强的过程。

神经肽Y Y_1受体是背根节神经元的胞体受体和脊髓背角神经元的连接后和突触后受体

用间接免疫荧光方法，将神经肽Ｙ Ｙ１ 受体免疫反应物质（ＬＩ）定位于大鼠腰段背根节小神经元和脊髓Ⅱ层神经元近细胞膜处。用共聚焦显微术显示背根神经元中Ｙ１ 受体－ＬＩ呈点状分布于神经元表面。在电子显微镜下发现Ｙ１ 受体－ＬＩ主要定位于背根节小神经元细胞膜下被膜囊泡、内在小体和管状池，有时也定位于细胞膜上。在脊髓Ⅱ层中，Ｙ１ 受体－ＬＩ定位于神经元细胞膜，许多树突为Ｙ１ 受体阳性，与未被标记的轴突终末形成突触；Ｙ１ 受体－ＬＩ主要定位于突触后膜以外的细胞膜，只有在少数情况下定位在突触后膜。表明在大鼠背根节小神经元中Ｙ１ 受体为胞体受体，并参与受体内在化过程；在脊髓背角神经元中，Ｙ１ 受体是连接后／突触后受体。

模拟高原急性缺氧对大鼠下丘脑神经肽Y受体Y1 mRNA表达的影响

目的探讨高原急性缺氧对大鼠食欲及其下丘脑神经肽Y受体Y1mRNA表达的影响。方法雄性Wistar大鼠随机分为平原对照组、3000m缺氧组、4000m缺氧组,5000m缺氧组和6000m缺氧组,各缺氧组设置缺氧后1、2、3d3个时相点,观察低氧环境下大鼠食欲的变化;采用RT-PCR方法检测大鼠下丘脑中Y1受体mRNA的表达。结果①高原急性缺氧后,大鼠食欲减退。②对照组和缺氧组大鼠下丘脑中均存在Y1受体mRNA表达。高原急性缺氧后,下丘脑Y1受体mRNA表达降低,并随着海拔高度的上升和缺氧时间的延长逐渐降低。结论高原急性缺氧对大鼠食欲有抑制作用;高原急性缺氧后下丘脑Y1受体mRNA表达降低,这可能是大鼠食欲减退的重要原因之一。

神经肽Y及其Y1受体阳性细胞在鸭腔上囊中的分布及发育变化(英文)

神经肽Y及其Y1受体在神经-免疫-网路中发挥着重要作用。二者在许多脊椎动物胸腺和脾脏中的表达已有研究,但它们在腔上囊中的表达及发育变化特征还未见报道。本试验应用免疫组化技术研究神经肽Y及其Y1受体阳性细胞在鸭腔上囊胚胎及胚后发育中的分布及变化特征。结果显示,在鸭腔上囊中神经肽Y及其Y1受体分别最早表达于26和22d胚龄。神经肽Y阳性细胞分布于黏膜上皮、滤泡、肌层和小动脉平滑肌。Y1受体阳性细胞分布于黏膜上皮、滤泡淋巴细胞。各部位神经肽Y及其Y1受体阳性细胞数量表现出明显增龄变化特征。结果说明鸭腔上囊中存在神经肽Y及其Y1受体,二者可能存在的相互作用主要表现在胚后发育阶段,这与B淋巴细胞的发育与分化以及腔上囊的退化密切相关。

去卵巢大鼠雌激素替代后背根神经节P2Y_1受体表达增加

目的考察痛觉敏感性与体内雌孕激素水平的可能关系。方法将大鼠分为去卵巢组(8只)和去卵巢后雌激素替代组(8只),去卵巢组通过去卵巢手术降低大鼠体内卵巢激素水平,去卵巢后雌激素替代组在去卵巢手术后1周给予外源性雌激素替代。分别在两组大鼠足底注射P2Y1选择性激动剂2-MeSADP,通过行为学实验观察对大鼠足底机械痛阈的影响,并通过实时定量PCR研究2组大鼠背根神经节(DRG)中P2Y1受体mRNA表达的差别。结果与去卵巢组大鼠相比,雌激素替代组大鼠机械痛阈增高(P=0.014);足底注射P2Y1选择性激动剂2-MeSADP后,去卵巢组大鼠在注射药物前后痛阈无统计学差异,而雌激素替代组大鼠出现痛觉增敏。实时定量PCR结果表明雌激素替代组大鼠DRG P2Y1受体mRNA的表达高于去卵巢组大鼠(P<0.05)。结论雌激素可能通过促进DRG上P2Y1受体的表达从而影响外周机械痛阈。

P2Y_1受体介导Aβ_(25-35)所致大鼠星形胶质细胞活化

目的:观察嘌呤受体P2Y1在Aβ25-35所致的大鼠星形胶质细胞活化中所起的作用。方法:体外分离培养大鼠星形胶质细胞,按空白对照、Aβ25-35和P2Y1受体阻断剂MRS2179+Aβ25-35和MRS2179分组干预后,通过免疫细胞化学、免疫荧光法和Western blotting方法观察GFAP和P2Y1表达的变化。结果:各组细胞数量无明显变化。与对照组相比,Aβ25-35组GFAP荧光强度明显增加;MRS2179+Aβ25-35和MRS2179组均降低,两组间无明显差异。Western blotting显示GFAP在各组间表达与免疫荧光法有相似趋势;与对照组相比,P2Y1表达在Aβ25-35组明显增多(P<0.05)和MRS2179+Aβ25-35和MRS2179组无明显变化(P>0.05)。结论:Aβ25-35通过P2Y1受体活化激活星形胶质细胞。