人类X染色体Xp11.3～21.3区部分YAC重叠群构建及大尺度物理图谱分析

人类Ｘ染色体短臂１１．３～２１．３区是含有视网膜色素变性等数种遗传病基因位点的区域。我们对这个具有重要医学生物学意义的区段进行了ＹＡＣ重叠群构建及大尺度物理作图。用这一区域已知的探针（ＯＴＣ、２ｂＡ３、ＤＭＤｃＤＮＡ），以ＹＡＣ菌落原位杂交法及ＰＣＲ法进行了ＹＡＣ的筛选；也采用了法国ＣＥＰＨ和英国ＩＣＲＦ的部分ＹＡＣ，总共得到了７７年阳性ＹＡＣ。对上述ＹＡＣ进行了长度测定。２６对微卫星ＳＴＳ图谱分析，单拷贝探针的杂交定位，Ａｌｕ－ＰＣＲ指纹图谱分析和稀切点酶大尺度物理图谱分析。综合上述信息，对这些ＹＡＣ进行了排序，在Ｘｐ１１．３～２１．３区得到了６个ＹＡＣ重叠群，总共覆盖了约１５．３Ｍｂ的范围。这些ＹＡＣ重叠群的构建为开展该区域疾病基因的定位克隆（Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｃｌｏｎｉｎｇ）及ＤＮＡ顺序测定奠定了基础。

濒危畜禽品种YAC基因组文库的构建

尽管酵母人工染色体 (Yeast artificial chrom osome,YAC)存在着克隆效率低、嵌合体出现率高、部分克隆不稳定和缺失等弊端 ,但由于它容纳高分子量 DNA的优点其它载体无法替代 ,而成为人类和动物基因组研究中最为主要的研究工具之一。因此 ,利用 YAC载体系统构建我国濒危畜禽品种的基因组文库 ,对于在分子水平保存国家重要的基因资源和深入的分子生物学研究等方面 ,均具有非常重要的意义。

4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯通过PTEN/PI3K/Akt抑制YAC-1细胞增殖和诱导其分化

目的研究新型维甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯（4-amino-2-trifluoromethyl—phenylretinate，ATPR）对鼠淋巴瘤YAC-1细胞增殖和分化的作用及其可能机制。方法不同浓度的ATPR作用鼠淋巴瘤YAC-1细胞后，MTT检测细胞生长抑制率；LDH法检测细胞毒性；瑞氏-吉姆萨染色法检测细胞形态；NBT检测细胞分化阳性率；RT—PCR和Westernblot法检测维甲酸受体mRNA和蛋白表达变化；Westernblot法检测FFEN／P13K／Akt和cyclinD的蛋白表达。结果ATPR（10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9mol·L^-1）用药后72h明显抑制YAC-1细胞增殖，其抑制作用随浓度和时间增加而逐渐增强；随着药物浓度升高，ATPR对YAC-1细胞毒性增强；ATPR（10^-5～10^-9mol·L^-1）作用72h后可诱导YAC-1细胞形态呈现高分化趋势，且NBT阳性率升高；ATPR（10^-5mol·L^-1）体外用药72h可诱导RARα的mR—NA和蛋白表达升高，但RARβ和RARγ表达无明显变化；而且可诱导PTEN表达升高并下调p-Akt和cyclinD的蛋白表达。结论ATPR可明显抑制YAC-1细胞增殖并诱导其分化，其机制可能是与RARα结合后参与调节PTEN／P13K／Akt信号通路，从而抑制cyclinD的过表达。

用万能引物PCR法从YAC中分离制备荧光原位杂交探针的研究

报道了一种从微量且未知碱基顺序的YAC DNA中制备FISH探针的新方法——万能引物PCR(UP PCR),即把复性后的UP-Linker连接于PFGE分离后经Alu Ⅰ酶切的YAC DNA上,再用UP对其进行PCR扩增和标记。由于Alu Ⅰ的广谱性和UP与Linker长度不同等,使该法能根据PCR效率调节扩增产物的广泛性向特异性的转变,且产物能覆盖YAC嵌入DNA的全长。此法制备的人21号染色体FISH探针,特异性强,杂交信号明亮,21号染色体的检出率高。该法稳定简便。

人X染色体2bA3－YAC克隆重叠群的构建及其与DMD－YAC的串联

用Ａｌｕ－ＰＣＲ指纹图谱法分析了人Ｘｐ２１．１一２１．２上一系列的ＹＡＣ克隆，发现其中的两个ＹＡＣ克隆构成包含ＤＸＳ１６６位点的重叠群，而且这一重叠群与以前构建的包含ＤＭＤ基因全顺序的ＹＡＣ重叠群相连接，ＹＡＣ克隆未端探针杂交证实了这一重叠，使这一ＹＡＣ重叠群至少延伸至ＤＸＳ１６６位点，形成一个跨度为３．５Ｍｂ的ＹＡＣ大重叠群。这一工作为这一区域进一步的图谱分析及ＤＭＤ基因的５′远端调控和该区域未知基因克隆奠定了基础。

几种从凝胶中回收YAC DNA的方法及其效果的比较

几种从凝胶中回收ＹＡＣＤＮＡ的方法及其效果的比较＊朱冠山缪为民△周炜▲姚玉河▲焦炳华△柴建华▲自１９８７年首次构建了人类基因组酵母人工染色体（ＹＡＣ）分子克隆库［１］，目前ＹＡＣ的克隆容量已达８００～１０００ｋｂ，由此而成为基因组作图和测序的一个最重...

人类X染色体Xp21．3－11．3区YAC重叠群的构建

人类Ｘ染色体短臂２１．３—１１．３区是含有视网膜色素变性等数种遗传病基因位点的区域。我们对这个具有重要医学生物学意义的区段进行了ＹＡＣ重叠群构建。用这一区域已知的探针（ＯＴＣ、ＤＸＳ１６６、ＤＭＤｃＤＮＡ）及ＳＴＳ位标，以ＹＡＣ菌落原位杂交法及ＰＣＲ法进行了ＹＡＣ的筛选；也采用了法国ＣＥＰＨ和英国ＩＣＲＦ的部分ＹＡＣ；总共得到了５５个阳性ＹＡＣ。对上述ＹＡＣ进行了长度测定，２６对微卫星ＳＴＳ图谱分析，单拷贝探针的杂交定位，Ａｌｕ－ＰＣＲ指纹图谱分析。综合上述信息，对这些ＹＡＣ进行了排序，在Ｘｐ２１．３－１１．３区得到了６个０ＹＡＣ重叠群，覆盖了约１５Ｍｂ的范围。这些ＹＡＣ重叠群的构建为开展该区域疾病基因的定位克隆（Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｃｌｏｎｉｎｇ）及ＤＮＡ顺序测定奠定了基础。

动物乳腺组织高效表达通用型YAC载体的构建

以含有人α-乳白蛋白基因功能域的YAC(yeast artificial chromosome)为起始材料，构建了可以在动物乳腺高效表达外源基因的载体系统。根据已发表的人α-乳白蛋白基因序列，通过PCR的方法，扩增出了其5’端的837bp及3’端的1007bp片段，构建了整合型载体pRLA22。利用pRLA22在大肠杆菌中进行基因操作，可以将外源基因准确地置于乳白蛋白基因启动子控制之下。把重组的pRLA22导入含YAC的酵母菌后，高频率同源重组事件将会把外源基因插入YAC。本实验通过上述程序，将鸡的γ-干扰素基因cDNA序列导入了YAC。经过PCR检测，证明鸡的γ-干扰素cDNA序列已被重组到YAC的预定位置。因此，大肠杆菌载体pRLA22和含人的α-乳白蛋白基因的YAC，将构成能在动物乳腺高表达外源基因的有效载体系统。

Alu-PCR联合荧光原位杂交技术鉴定bcr基因相关YAC克隆

目的制备慢性髓细胞性白血病（ＣＭＬ）ｂｃｒ基因重排的ＤＮＡ探针。方法应用Ａｌｕ－ＰＣＲ和荧光原位杂交（ＦＩＳＨ） 技术，对３个酵母人工染色体（ＹＡＣ）候选克隆进行鉴定，制备ＤＮＡ探针，并经正常人外周血淋巴细胞和慢性髓细胞性 白血病患者骨髓细胞筛选。结果确定了ＹＡＣ７６５Ｅ３为非嵌合体，定位于染色体２２ｑｌｌ ｂｃｒ基因区域，而且可在Ｐｈ染 色体阳性细胞中易位至９ｑ３４。探针特异性杂交效率达９５％。结论ＦＩＳＨ技术是染色体、染色体畸变鉴定和染色体上特 殊序列定位的重要检测方法。联合应用Ａｌｕ－ＰＣＲ技术特异性扩增载体ＹＡＣ中人类基因组来源的ＤＮＡ制备探针，为慢性髓细胞白血病的诊断和监测微小残留病提供了一个新的手段。

人X染色体YAC图谱分析及DMD基因研究──在第二届联合国教科文组织南北人类基因组学术会议上的报告

人Ｘ染色体ＹＡＣ图谱分析及ＤＭＤ基因研究──在第二届联合国教科文组织南北人类基因组学术会议上的报告柴建华（复旦大学遗传学研究所人类基因组实验室上海２００４３３）我们实验室从１９８７年在国家高技术发展计划（８６３）的资助下开始人类基因组研究。现在还同时...

人类YAC库PCR三维筛选体系的建立及质量考核

为了在知道某个区域、位点、基因或ＤＮＡ片段的部分信息后，能从ＣＥＰＨＹＡＣ库中筛选出与其对应的ＹＡＣ克隆，为进一步研究奠定基础，需要建立一个筛选体系。本文概述了这一筛选体系的建立过程。随后，用两对与已知基因对应的引物进行了筛选验证工作，证明了这一体系的可用性，同时提出了以后筛选的途径，即首先筛选ＹＡＣ库的ＭｅｇａＹＡＣ部分，并以５块板为一组进行筛选。另外，运用荧光原位杂交技术（ＦＢＨ），对ＣＥＰＨＹＡＣ库的质量及其第一代人类基因组物理图谱进行了考察。我们取２６个ＹＡＣ克隆进行ＦＩＳＨ定位，结果其中嵌合体１３个，占５０％。定位错误的克隆有６个，占２３％。非嵌合体且定位正确的共９个，占３５％。

水稻核基因组DNA的YAC克隆和鉴定

将EcoRⅠ部分消化的水稻(Oryza saliva L.)细胞核高分子量DNA电泳分部,回收大于200kb的片段,与内切酶消化过的酵母人工染色体(YAC)双质粒载体pJS97,pJS98DNA连接,转化酵母YPH252感受态原生质球,用Ura^-,TrP^-双选择培养基直接筛选转化子,已获得2000多个克隆。转化子DNA的Southern杂交显示插入片段在200～820kb范围。

人基因组YAC分子克隆库的构建及DMD基因YAC克隆的筛选

以pYAC4为载体,以正常人白细胞和含4条X染色体的细胞株GM1414为DNA源构建成人基因组YAC(Yeast Artificial Chromosome,酵母人工染色体)分子克隆库,已得到原始克隆近2万个,插入DNA片段长度在400—1000kb,从其中选出一组YAC克隆,它们含有DMD基因全部DNA顺序。

基因组YAC文库构建方法的几点改进

以ｐＪＳ９７、ｐＪＳ９８为载体，对中国人基因组ＹＡＣ文库的构建进行了尝试建立了一种对小片段ＤＮＡ“原位电泳筛除”的方案，采用多胺溶液处理以减少大片段ＤＮＡ的降解，使整个建库工作更加简便、有效．此外，改进了转化子的挑取和保存的方法，既简化了操作，又减少了杂菌污染和交叉污染．这些改进的方案。

不同条件下人乳白蛋白YAC的高效定点打靶修饰

目的?对人乳白蛋白酵母人工染色体(HLA-YAC)进行定点改造,以便进一步利用该载体作与基因表达调控相关的 研究。方法:借助kar1突变使YPH925菌株与异交配型菌株交配时丧失核融合的能力,把HLA-YAC由酵母AB1380转移到 his3缺陷的YPH925菌株。分别以HIS3(对YPH925菌株)和G418R(对YPH925和AB1380两种菌株)为选择标记,用含 HLA-YAC的酵母基因组为模板,PCR克隆人乳白蛋白(HLA)基因的5′和3′端非翻译区各684bp和940bp为同源臂,构建 打靶载体,线性化的打靶载体经电转化或醋酸锂转化转入酵母内,以菌落PCR为鉴定方法,辅以测序验证。结果:HLA-YA 在目的位置完成了定点打靶修饰,G418R的筛选效率高于HIS3,醋酸锂转化方法的打靶效率稍高于电转化。结论:对YA 的成功修饰为在动物体内的表达及调控研究打下了基础。

羊膜对YAC-1细胞增殖影响的实验研究

目的 观察羊膜对其基质面培养的 YAC- 1细胞增殖的影响。方法 将 YAC- 1细胞接种于羊膜基质面 ,用 MTT自动比色法分别于接种后 1、3、7d检测羊膜对 YAC- 1细胞增殖的影响。结果 接种后 1、3、7d,羊膜均对 YAC- 1细胞有明显的促增殖作用 (P<0 .0 1)。结论 羊膜有促进肿瘤细胞增殖的作用 。

8p11.2亚带ANK1位点附近区域YAC连续克隆群的构建

我们分离了３个８ｐｌ１．２亚带ＡＮＫ１位点附近区域的单拷贝片段，应用这些片段之一Ｓ９２５作为探针筛到４个阳性ＣＥＰＨＹＡＣ（ｙｅａｓｔａｒｔｉｆｉｃｉａ１ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）克隆。结合文献报道资料及其多态性位标检测结果，我们在ＡＮＫ１附近区域构建一个ＹＡＣ连续克隆群，从而填补了Ｄ８Ｓ５３２和Ｄ８Ｓ２６８之间的间隙。这个ＹＡＣ连续克隆群可用于分离基因。

水文YAC2000自动化报汛系统故障分析及维护

根据多年系统维护的经验,着重对YAC2000自动化报汛系统、信道、雨量自计、水位自计等的常见故障进行诊断和分析,保证设备的正常运行,充分发挥其在防汛中的作用。

kar交配法转移YACs至新宿主的研究

利用改进的kar交配法,将一个含有340kb人基因组DNA的YAC片段的供体酵母菌株YAC23与受体菌株YLB504进行交配,以选择平板对所形成的候选YAC导入菌进行筛选。经PCR分析,候选YAC导入菌在404bp处有一个扩增带,即具有受体菌株的交配型(MAT α)。进一步用脉冲电泳进行核型鉴定,证实YACs己成功地进入受体,实现了YACs从一个宿主到另一个宿主之间的转移。