绵羊YAP1基因的克隆及其真核表达载体和突变型载体的构建

本研究旨在克隆绵羊YAP1基因CDS序列,构建并鉴定其真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1,及其磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1S42A。本研究利用RT-PCR技术,从湖羊背最长肌克隆YAP1基因编码区序列,T-A克隆到pMD 19-T载体中,进行测序。利用酶切和T4连接酶连接方法,将YAP1基因编码区克隆到pEGFP-C 1载体中,构建pEGFP-C 1-YAP1真核表达载体,以真核表达载体为模板,构建磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1S42A,2种载体均进行PCR、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切、BamHⅠ单酶切及测序鉴定。结果克隆出YAP1基因的全长cDNA序列,获得GenBank登录号JQ 714252,其长度为1 712bp,编码区1 212bp,编码403个氨基酸。重组质粒pEGFP-C1-YAP1经PCR、酶切、测序鉴定,证实YAP1基因CDS区已正确克隆入pEGFP-C1表达载体;经测序鉴定,YAP1第42位丝氨酸成功突变为丙氨酸。本研究成功克隆绵羊YAP1基因全长cDNA序列,并构建了重组真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1及磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1S42A,为进一步研究YAP1蛋白表达及其生物学活性奠定基础。

星形细胞瘤中YAP1和β-catenin的表达及临床联系

目的探寻Yes相关蛋白1(YAP1)和β-联蛋白(β-catenin)在Ⅰ~Ⅳ级星形细胞瘤中的表达及意义。方法应用免疫组织化学Elivision两步法检测2013年1月至2020年12月该院收治的确诊且有完整病理检查资料的52例不同级别星形细胞瘤及10例正常脑组织中YAP1和β-catenin的表达及相关性,分析二者与临床病理参数及患者预后的关系。结果52例星形细胞瘤中YAP1和β-catenin的表达均明显高于正常脑组织,Ⅰ~Ⅱ级星形细胞瘤中YAP1和β-catenin的表达均明显高于Ⅲ~Ⅳ级,差异均有统计学意义(P<0.05);YAP1和β-catenin在星形细胞瘤中的表达主要受肿瘤大小、级别的影响,且二者表达呈正相关(r=0.553,P<0.05);二者共同表达可缩减患者生存期。结论YAP1和β-catenin在星形细胞瘤中的表达随肿瘤级别增高而增强,且二者表达呈正相关。

四环素诱导的YAP1敲减系统的建立及其对胃癌细胞功能的影响

目的建立一种四环素(tetracycline,DOX)诱导的基因敲减系统,并利用此系统研究YAP1对胃癌细胞功能的影响。方法构建pLKO.1-tetON-YAP1敲减的慢病毒载体,酶切和测序方法检测载体构建成功与否;慢病毒感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,建立DOX诱导的YAP1敲减的胃癌细胞系;RT-PCR检测YAP1 mRNA相对表达量,Western blotting检测YAP1蛋白水平变化;平板克隆实验检测细胞增殖情况;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移的情况。结果构建四环素诱导的YAP1敲减的病毒质粒,酶切鉴定结果显示,在6000 bp和3000 bp处各有一条带,测序结果与设计的shRNA序列一致。包装慢病毒并感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,DOX诱导组中,感染pLKO.1-tetON-YAP1的病毒的细胞中YAP1 mRNA的相对表达量和蛋白水平明显下调;而未诱导组则无明显变化。平板克隆形成实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组克隆形成数明显降低;未诱导组无明显变化。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组表达后细胞迁移能力受到抑制,未诱导组无明显变化。结论成功建立了四环素诱导的慢病毒系统,利用此系统敲减胃癌细胞YAP1基因,胃癌细胞增殖和迁移能力受到抑制。

人YAP1基因亚型的质粒构建及表达鉴定

目的:构建人Yes相关蛋白1(YAP1)基因亚型1δ、2δ的真核表达载体并进行瞬时表达鉴定,为研究YAP1亚型间的区别及其在肿瘤中的作用打下基础。方法:在已有pCI_2-Flag-YAP1-2γ质粒的基础上,利用重叠PCR增加碱基的方法得到YAP1-2δ的片段,再同理删减WW基因序列得到YAP1-1δ片段,通过Cla I和Sal I两个酶切位点将片段和pCI_2载体相连接,构建pCI_2-Flag-YAP1-1δ及pCI_2-Flag-YAP1-2δ质粒。利用测序确认完整的DNA序列。在HEK293细胞中瞬时转染质粒,用Western blot方法检测YAP1两个亚型的蛋白表达。结果:重组质粒经双酶切和基因测序比对鉴定正确,HEK293细胞经瞬时转染表达出YAP1-1δ和YAP1-2δ蛋白。结论:成功构建了pCI_2-Flag-YAP1-1δ及pCI_2-Flag-YAP1-2δ真核表达质粒,并在HEK293细胞内过表达成功。为进一步探讨YAP1各亚型对肿瘤发展的影响奠定基础。

Hippo信号通道中Lats2基因表达与湖羊肌肉生长发育的关系

[目的]探究Hippo信号通道中Lats2基因与湖羊肌肉生长发育的关联性。[方法]以湖羊作为试验材料,用RT-qPCR技术分析Lats2基因在不同性别、不同生长阶段(2、60、180日龄)、不同肌肉组织(比目鱼肌、背最长肌、腓肠肌和趾长伸肌)的时空表达规律,及其与Lats1、YAP1(Yes相关蛋白1)基因和肌肉生长相关基因在不同生长阶段的相关性。[结果]根据Hippo信号通道中Lats2基因的时空表达规律可以发现:在不同肌肉组织中,Lats2基因在趾长伸肌中相对表达量最高;在不同生长阶段,Lats2基因在60日龄的表达量最高;在不同性别中,Lats2基因的表达表现为公羊高于母羊。相关性分析结果表明:在2日龄肌肉组织中,Lats2基因的表达与MSTN基因间正相关(P<0.05);在60日龄的肌肉组织中,Lats2基因的表达与Lats1基因正相关(P<0.05);在180日龄肌肉组织中,Lats2基因的表达与MyoG基因间极显著正相关(P<0.01),与YAP1基因间显著负相关(P<0.05)。[结论]Hippo信号通道中Lats2基因的表达受不同性别、年龄和肌肉组织的影响,可能通过下调YAP1基因的表达抑制肌肉生长发育,可作为肌肉生长发育调控研究的候选基因。

下调YAP1基因对子宫内膜癌顺铂耐药细胞的影响及机制探究

目的观察下调YAP1基因对子宫内膜癌顺铂耐药细胞的影响。方法子宫内膜癌顺铂耐药细胞株Ishikawa/DDP分为Ishikawa/DDP-siRNA-YAP1组(转染siRNA-YAP1的细胞)、阴性对照组(转染siRNA-NC的细胞)和空白对照组(未经转染的细胞),MTT法及癌细胞单克隆形成数目检测细胞增殖,Transwell小室检测侵袭,划痕检测迁移,AnnexinV-FITC/PI双染法检测凋亡,免疫荧光检测自噬现象,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和自噬相关蛋白LC3β、p62。结果24 h、48 h、72 h,Ishikawa/DDP-siRNA-YAP1组OD值明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),细胞克隆数明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);细胞迁移率明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);细胞侵袭数明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);免疫荧光结果显示与阴性对照组和空白对照组比较,Ishikawa/DDP-siRNA-YAP1组绿色、红色以及黄色光点明显减少,即自噬小体堆积明显减少,Ishikawa/DDP-siRNA-YAP1组自噬蛋白LC3β和p62蛋白表达明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);细胞凋亡率高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),凋亡蛋白Bcl-2表达明显低于阴性对照组和空白对照组,Bax表达明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。结论下调YAP1可能通过抑制自噬,从而抑制细胞增殖、侵袭以及迁移,同时促进凋亡,YAP1有可能成为逆转子宫内膜癌化疗耐药的新靶点。

YAP1基因新发致病性变异致孤立性眼组织缺损一家系

目的确定并观察1个孤立性眼组织缺损(MAC)家系的致病基因变异与临床表型特征。方法回顾性研究。2019年5月至2022年5月于河南省立眼科医院就诊的MAC一家系1例患者和3名家系成员纳入研究。详细询问患者病史和家族史,并行最佳矫正视力(BCVA)、裂隙灯显微镜、超广角眼底彩色照相、光相干断层扫描(OCT)、B型超声检查以及眼轴长度(AL)测量。采集先证者及其父母、兄长的外周静脉血行Trio全外显子组测序,进行致病基因筛查;荧光定量聚合酶链反应验证相关变异。同时观察患者眼部及全身临床特征。结果先证者男,首次就诊时3岁。双眼眼球水平钟摆样震颤。竖椭圆形小角膜(水平直径约8.0 mm);虹膜下方缺损,呈"锁孔"状。首次就诊时(3岁)屈光度:右眼-4.00 DS/-0.50 DC×105°,左眼-3.50 DS/-1.25 DC×80°;随访3年后(6岁)屈光度及BCVA:右眼-6.50 DS/-2.00 DC×110°→0.05,左眼-6.00 DS/-1.50 DC×80°→0.2。AL:4岁10个月,右眼、左眼分别为24.62、23.92 mm;5岁7个月,右眼、左眼分别为25.24、24.36 mm.B型超声检查,双眼眼球组织缺损。超广角眼底彩色照相检查,包括视盘的下方脉络膜广泛缺损。OCT检查,双眼视盘形态结构异常,周围可见片状脉络膜缺损,缺损区神经上皮结构紊乱、变薄;左眼可见神经上皮劈裂。先证者父母及兄长表型正常。全外显子组测序结果显示,先证者YAP1基因6~9号外显子存在一个新的杂合缺失变异:YAP1,chr11:102080247-102100671,NM_001130145,loss1(EXON:6-9);生物信息学分析结果为致病变异。父母及兄长为野生型。结论发现并证实YAP1基因6~9号外显子杂合缺失为本家系的致病变异;可引起眼前节发育异常、脉络膜缺损、轴性近视加深,缺损累及黄斑与视网膜劈裂。

干扰YAP1对食管癌Eca-109细胞生物学功能的影响

该文研究Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)对Eca-109细胞生物学功能的影响。构建针对YAP1基因的sh RNA慢病毒载体,转染Eca-109细胞,采用q PCR和蛋白印迹法检测转染前后Eca-109细胞中YAP1 m RNA和蛋白以及P53蛋白的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期、凋亡情况;CCK-8实验检测细胞的增殖情况变化。结果显示,慢病毒转染组细胞内YAP1 m RNA和蛋白表达量低于空白对照组和空病毒转染组,p53基因表达量高于空白对照组和空病毒转染组;Eca-109细胞增值率从第3 d开始低于对照组(P<0.05);慢病毒转染组细胞G1期比例增高(P<0.05),早期凋亡率增加(P<0.05),以上差异均有统计学意义。结果表明,干扰YAP1可诱导Eca-109细胞凋亡,降低Eca-109细胞的增殖能力,且其抗凋亡的作用可能部分与p53基因相关。

YAP1基因沉默诱导甲状腺癌细胞凋亡及逆转免疫抑制的机制研究

目的探讨沉默K4P1基因表达对甲状腺癌细胞凋亡及免疫抑制因子表达的影响。方法将实验分为空白组(未进行处理的K1细胞)、NC组(K1细胞转染阴性对照siRNA)和si-YAP1组(K1细胞转染YAP1特异性siRNA)。MTT法检测siRNA转染4d细胞活力;流式细胞术及Western印迹分别检测si-YAP1转染K1细胞48h的细胞凋亡率及YAP1、VEGF、TGF-β1、AKT、p-AKT和Bax蛋白表达。结果si-YAP1的转染可明显降低K1细胞YAP1蛋白表达,与空白组比较有显著性差异(P<0.05)。si-YAP1组和空白组比较,细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,VEGF、TGF-β1和p-AKT蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论沉默表达可诱导甲状腺癌细胞凋亡,且逆转免疫抑制,机制可能与PI3K/AKT信号的下调有关。

化生性胸腺瘤的临床病理学特征及分子病理检测

目的探讨化生性胸腺瘤(metaplastic thymoma,MT)的临床病理学特征、分子遗传学特征及检测策略。方法对解放军东部战区总医院病理科2011—2021年诊断的10例MT进行光镜观察、免疫组织化学染色及随访,并采用荧光原位杂交(FISH)、二代测序和C-末端YAP1抗体(YAP1-CT)检测MT中的YAP1::MAML2基因融合。结果10例患者中男性4例,女性6例。患者年龄29~60岁,平均年龄50岁,中位年龄54岁。镜下肿瘤表现为特征性的双相结构,由上皮细胞和梭形细胞组成,2种成分突然转化或逐渐过渡,并且在不同病例中比例变化很大。免疫表型:上皮细胞广谱细胞角蛋白(CKpan)、细胞角蛋白(CK)5/6、p63均弥漫阳性;梭形细胞波形蛋白弥漫阳性,上皮细胞膜抗原(EMA)局灶阳性;间质淋巴细胞末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)阴性;Ki-67阳性指数均<5%。YAP1和MAML2分离FISH结果显示,10例MT中均可见间隔较小且距离接近2个信号宽度的分离信号,可能被误判为阴性。采用YAP1::MAML2融合FISH检测,10例MT均观察到异常的融合信号。二代测序显示,8例组织足够的病例均检测到YAP1::MAML2融合基因,其中DNA测序检测出2例,RNA测序检测出8例。YAP1-CT在所有10例MT的上皮细胞中均表达缺失。结论MT是一种罕见的低度恶性的胸腺肿瘤,具有特征性的双相结构和YAP1::MAML2融合。由于YAP1和MAML2这两个基因相距较近,分离FISH结果可能被误判为阴性。YAP1-CT是诊断MT高度灵敏和特异的标志物,其表达缺失可用于MT中YAP1::MAML2融合的筛查。