绵羊YAP1基因的克隆及其真核表达载体和突变型载体的构建

本研究旨在克隆绵羊YAP1基因CDS序列,构建并鉴定其真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1,及其磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1S42A。本研究利用RT-PCR技术,从湖羊背最长肌克隆YAP1基因编码区序列,T-A克隆到pMD 19-T载体中,进行测序。利用酶切和T4连接酶连接方法,将YAP1基因编码区克隆到pEGFP-C 1载体中,构建pEGFP-C 1-YAP1真核表达载体,以真核表达载体为模板,构建磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1S42A,2种载体均进行PCR、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切、BamHⅠ单酶切及测序鉴定。结果克隆出YAP1基因的全长cDNA序列,获得GenBank登录号JQ 714252,其长度为1 712bp,编码区1 212bp,编码403个氨基酸。重组质粒pEGFP-C1-YAP1经PCR、酶切、测序鉴定,证实YAP1基因CDS区已正确克隆入pEGFP-C1表达载体;经测序鉴定,YAP1第42位丝氨酸成功突变为丙氨酸。本研究成功克隆绵羊YAP1基因全长cDNA序列,并构建了重组真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1及磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1S42A,为进一步研究YAP1蛋白表达及其生物学活性奠定基础。

鸭YAP1基因编码区的克隆、生物信息分析及其组织表达特性

【目的】旨在克隆鸭YAP1基因,预测其蛋白结构、功能及其组织表达特性。【方法】以北京肉鸭为材料,采用RT-PCR技术克隆鸭YAP1基因CDS区,利用多种生物信息学分析软件预测其结构与功能,并应用荧光定量PCR检测其组织表达特性。【结果】结果表明:鸭YAP1基因CDS全长1 248bp,编码415个氨基酸,氨基酸水平上与鸡相似性最高,达99.7%;氨基酸序列分析发现鸭YAP1蛋白相对分子量为45 417.5Da,主要定位在细胞核,属水溶性蛋白,不属于分泌蛋白;预测鸭YAP1氨基酸含有磷酸化、糖基化位点各30个;含两个WW结构域,且不同物种间结构域较保守;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构呈弯曲状螺旋结构;荧光定量结果显示,YAP1在胰脏中表达量最高,肌肉组织中最低。【结论】鸭YAP1基因非常保守,结构、功能与哺乳动物具较高一致性。

人YAP1基因亚型的质粒构建及表达鉴定

目的:构建人Yes相关蛋白1(YAP1)基因亚型1δ、2δ的真核表达载体并进行瞬时表达鉴定,为研究YAP1亚型间的区别及其在肿瘤中的作用打下基础。方法:在已有pCI_2-Flag-YAP1-2γ质粒的基础上,利用重叠PCR增加碱基的方法得到YAP1-2δ的片段,再同理删减WW基因序列得到YAP1-1δ片段,通过Cla I和Sal I两个酶切位点将片段和pCI_2载体相连接,构建pCI_2-Flag-YAP1-1δ及pCI_2-Flag-YAP1-2δ质粒。利用测序确认完整的DNA序列。在HEK293细胞中瞬时转染质粒,用Western blot方法检测YAP1两个亚型的蛋白表达。结果:重组质粒经双酶切和基因测序比对鉴定正确,HEK293细胞经瞬时转染表达出YAP1-1δ和YAP1-2δ蛋白。结论:成功构建了pCI_2-Flag-YAP1-1δ及pCI_2-Flag-YAP1-2δ真核表达质粒,并在HEK293细胞内过表达成功。为进一步探讨YAP1各亚型对肿瘤发展的影响奠定基础。

下调YAP1基因对子宫内膜癌顺铂耐药细胞的影响及机制探究

目的观察下调YAP1基因对子宫内膜癌顺铂耐药细胞的影响。方法子宫内膜癌顺铂耐药细胞株Ishikawa/DDP分为Ishikawa/DDP-siRNA-YAP1组(转染siRNA-YAP1的细胞)、阴性对照组(转染siRNA-NC的细胞)和空白对照组(未经转染的细胞),MTT法及癌细胞单克隆形成数目检测细胞增殖,Transwell小室检测侵袭,划痕检测迁移,AnnexinV-FITC/PI双染法检测凋亡,免疫荧光检测自噬现象,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和自噬相关蛋白LC3β、p62。结果24 h、48 h、72 h,Ishikawa/DDP-siRNA-YAP1组OD值明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),细胞克隆数明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);细胞迁移率明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);细胞侵袭数明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);免疫荧光结果显示与阴性对照组和空白对照组比较,Ishikawa/DDP-siRNA-YAP1组绿色、红色以及黄色光点明显减少,即自噬小体堆积明显减少,Ishikawa/DDP-siRNA-YAP1组自噬蛋白LC3β和p62蛋白表达明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);细胞凋亡率高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),凋亡蛋白Bcl-2表达明显低于阴性对照组和空白对照组,Bax表达明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。结论下调YAP1可能通过抑制自噬,从而抑制细胞增殖、侵袭以及迁移,同时促进凋亡,YAP1有可能成为逆转子宫内膜癌化疗耐药的新靶点。

YAP1基因新发致病性变异致孤立性眼组织缺损一家系

目的确定并观察1个孤立性眼组织缺损(MAC)家系的致病基因变异与临床表型特征。方法回顾性研究。2019年5月至2022年5月于河南省立眼科医院就诊的MAC一家系1例患者和3名家系成员纳入研究。详细询问患者病史和家族史,并行最佳矫正视力(BCVA)、裂隙灯显微镜、超广角眼底彩色照相、光相干断层扫描(OCT)、B型超声检查以及眼轴长度(AL)测量。采集先证者及其父母、兄长的外周静脉血行Trio全外显子组测序,进行致病基因筛查;荧光定量聚合酶链反应验证相关变异。同时观察患者眼部及全身临床特征。结果先证者男,首次就诊时3岁。双眼眼球水平钟摆样震颤。竖椭圆形小角膜(水平直径约8.0 mm);虹膜下方缺损,呈"锁孔"状。首次就诊时(3岁)屈光度:右眼-4.00 DS/-0.50 DC×105°,左眼-3.50 DS/-1.25 DC×80°;随访3年后(6岁)屈光度及BCVA:右眼-6.50 DS/-2.00 DC×110°→0.05,左眼-6.00 DS/-1.50 DC×80°→0.2。AL:4岁10个月,右眼、左眼分别为24.62、23.92 mm;5岁7个月,右眼、左眼分别为25.24、24.36 mm.B型超声检查,双眼眼球组织缺损。超广角眼底彩色照相检查,包括视盘的下方脉络膜广泛缺损。OCT检查,双眼视盘形态结构异常,周围可见片状脉络膜缺损,缺损区神经上皮结构紊乱、变薄;左眼可见神经上皮劈裂。先证者父母及兄长表型正常。全外显子组测序结果显示,先证者YAP1基因6~9号外显子存在一个新的杂合缺失变异:YAP1,chr11:102080247-102100671,NM_001130145,loss1(EXON:6-9);生物信息学分析结果为致病变异。父母及兄长为野生型。结论发现并证实YAP1基因6~9号外显子杂合缺失为本家系的致病变异;可引起眼前节发育异常、脉络膜缺损、轴性近视加深,缺损累及黄斑与视网膜劈裂。

YAP1-TFE3基因融合的上皮样血管内皮瘤1例

患者女性,35岁,无明显诱因出现臀部疼痛1年余,无其他肿瘤病史及家族史。骶尾骨CT平扫示:骶骨、双侧髂骨、双侧股骨多灶骨肿瘤。骶椎MRI示:S1~S3椎体占位伴双侧髂骨、骶髂关节面、骶孔、骶神经受累,双侧股骨多发病灶(图1)。PET/CT示:胸10椎体、腰2椎体、骶骨、双侧髂骨、双侧股骨多发溶骨性骨质破坏区,双侧骶髂关节处伴软组织肿块形成;右肺基底段肺膜下结节。

鸡YAP1基因在不同生长发育时期卵泡中的时空表达分析

为探讨YAP1基因在鸡卵泡生长发育中的调控作用,以150 d海兰褐蛋鸡为供试材料,采用相对定量RT-PCR方法对YAP1基因在鸡卵巢组织不同发育时期卵泡中的mRNA转录水平进行检测分析,并用免疫组织化学方法对YAP1蛋白质分子在鸡前等级卵泡中的时空表达模式进行蛋白定位分析。结果表明:鸡YAP1基因mRNA在卵巢间质、前等级卵泡和不同等级化的卵泡中均有表达,但在不同等级的卵泡中表达差异不显著(P>0.05),呈现出组成型表达的特点。鸡YAP1蛋白质分子主要在卵巢间质组织、前等级卵泡卵母细胞和颗粒细胞中有表达,但在膜层细胞中未检测到其表达信号。此结果表明,YAP1分子可能主要以自分泌或旁分泌的方式在前等级卵泡的生长发育过程中发挥着重要调节作用。

YAP1基因沉默诱导甲状腺癌细胞凋亡及逆转免疫抑制的机制研究

目的探讨沉默K4P1基因表达对甲状腺癌细胞凋亡及免疫抑制因子表达的影响。方法将实验分为空白组(未进行处理的K1细胞)、NC组(K1细胞转染阴性对照siRNA)和si-YAP1组(K1细胞转染YAP1特异性siRNA)。MTT法检测siRNA转染4d细胞活力;流式细胞术及Western印迹分别检测si-YAP1转染K1细胞48h的细胞凋亡率及YAP1、VEGF、TGF-β1、AKT、p-AKT和Bax蛋白表达。结果si-YAP1的转染可明显降低K1细胞YAP1蛋白表达,与空白组比较有显著性差异(P<0.05)。si-YAP1组和空白组比较,细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,VEGF、TGF-β1和p-AKT蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论沉默表达可诱导甲状腺癌细胞凋亡,且逆转免疫抑制,机制可能与PI3K/AKT信号的下调有关。

四环素诱导的YAP1敲减系统的建立及其对胃癌细胞功能的影响

目的建立一种四环素(tetracycline,DOX)诱导的基因敲减系统,并利用此系统研究YAP1对胃癌细胞功能的影响。方法构建pLKO.1-tetON-YAP1敲减的慢病毒载体,酶切和测序方法检测载体构建成功与否;慢病毒感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,建立DOX诱导的YAP1敲减的胃癌细胞系;RT-PCR检测YAP1 mRNA相对表达量,Western blotting检测YAP1蛋白水平变化;平板克隆实验检测细胞增殖情况;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移的情况。结果构建四环素诱导的YAP1敲减的病毒质粒,酶切鉴定结果显示,在6000 bp和3000 bp处各有一条带,测序结果与设计的shRNA序列一致。包装慢病毒并感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,DOX诱导组中,感染pLKO.1-tetON-YAP1的病毒的细胞中YAP1 mRNA的相对表达量和蛋白水平明显下调;而未诱导组则无明显变化。平板克隆形成实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组克隆形成数明显降低;未诱导组无明显变化。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组表达后细胞迁移能力受到抑制,未诱导组无明显变化。结论成功建立了四环素诱导的慢病毒系统,利用此系统敲减胃癌细胞YAP1基因,胃癌细胞增殖和迁移能力受到抑制。