红鳍东方鲀AFP、CIRP、HMGB1和YB-1基因对低温胁迫的响应

鱼类的生长和繁殖受环境条件的调节,冬季的低温会给红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)产业带来不利影响。为研究红鳍东方鲀耐低温机制,本研究利用实时荧光定量PCR技术,分析抗冻蛋白(AFP)基因、冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因、高速迁移蛋白家族蛋白(HMGB1)基因、Y-box结合蛋白(YB-1)基因在不同温度条件下(18℃、13℃、8℃和5℃),在红鳍东方鲀的肝、脾、肾、脑、心、肠、肌肉、性腺和皮肤中的表达情况。结果显示,AFP基因呈广泛性表达,在肌肉中表达量最高(P<0.05),随着温度的降低,各组织中AFP基因的表达量基本呈显著升高的趋势,在5℃组达到最高值,显著高于对照组(P<0.05)。CIRP基因在肌肉中表达量最高(P<0.05),随着温度的降低,各组织中CIRP基因的表达量的升降程度有所不同,在肝、肾、脑、心、肠、皮肤中的表达量呈先升高后降低再升高的趋势,在脾、肌肉和性腺中表达量呈上升趋势。HMGB1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05),在脑、心、肝和皮肤中也有较高的表达量;随着温度的降低,除肝脏外,各组织中HMGB1基因的表达量基本呈先升高后降低的趋势,并在8℃组达到最大值,显著高于其他各组(P<0.05)。YB-1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05),在其他组织中表达量较低;随着温度的降低,大部分组织中(脑、心、肠、肾、肝、肌肉和脾)表达量呈先升高后降低再升高的趋势,在8℃组达到最小值(P<0.05)。以上结果表明,4种基因表达水平因组织、温度的不同而不同,反映了这4种基因的功能特异性;在低温胁迫下,4种基因积极响应,表达量均发生不同程度的变化,表明4种基因在红鳍东方鲀低温环境适应中可能具有潜在的重要作用。另外,从表达变化规律来看,8℃可能是红鳍东方鲀应对低温胁迫的关键调控点,过低的温度会造成其调控紊乱,这可为研究红鳍东方鲀低温应答调控机制提供相关依据。

人YB-1蛋白的高效原核表达、纯化及其多抗的制备

目的构建YB-1原核表达系统,诱导表达后纯化YB-1融合蛋白并制备其多抗。方法采用RT-PCR扩增YB-1编码序列,将该序列克隆至载体pET-32a(+);转化BL21(DE3),确定最佳表达条件;采用亲和层析与超滤纯化目的蛋白,经Western blot鉴定后免疫家兔,制备其抗体。结果成功扩增YB-1编码序列并构建了其表达载体;SDS-PAGE结果显示,表达条件经优化后(28℃,5h,0.5mmol/LIPTG),YB-1融合蛋白在BL21中得到高效可溶性表达;Western blot结果证实,表达产物经纯化后获得了纯度较高的YB-1融合蛋白,将该蛋白免疫家兔后获得了效价与特异性较高的抗体。结论成功建立了YB-1蛋白的原核表达系统及蛋白纯化方法 ,并制备了其抗体。

YB-1与肿瘤发生及治疗

Y-box结合蛋白(Y-box binding protein,YB)是一类广泛存在于从低等到高等多种生物中的蛋白质家族,在体内行使多种生物学功能.大量研究表明,YB-1作为该家族成员之一,与许多重要的生物大分子存在密切联系,并对细胞、组织和机体的生理机能产生重大影响.更为重要的是,YB-1在多种疾病,尤其是恶性肿瘤的发生和发展中也起到十分关键的作用,对癌细胞表型的维持及肿瘤多药耐药性(MDR)的产生具有全方位的影响.以YB-1为作用靶点的新型肿瘤治疗策略可望有效控制癌症患者病情恶化,改善耐药状况.现就对YB-1与肿瘤发生和发展之间关系的研究进展,以及针对YB-1治疗策略的制定作一评述和展望.

YB-1抑制三氧化二砷诱导的胃癌细胞自噬机制

目的研究YB-1抑制三氧化二砷(As2O3)诱导人胃癌BGC-823细胞自噬的机制。方法采用脂质体转染siRNA干扰YB-1和腺病毒转染pAd1Easy/YB-1过表达YB-1;实时荧光定量PCR检测Bcl-2和Beclin1基因转录;Western blot检测YB-1、Bcl-2、Beclin1、P62和LC3Ⅱ蛋白的表达;MDC染色、荧光显微镜观察自噬泡。结果与空病毒(AdGFP)组相比,pAd1Easy/YB-1(AdYB-1)组Bcl-2基因表达增高,而干扰质粒(siYB-1)组Bcl-2基因表达水平较空质粒(HK)组降低(P均<0.05),各组Beclin1基因表达比较无统计学差异。与AdGFP和HK组相比,AdYB-1组Beclin1和LC3Ⅱ蛋白减少,Bcl-2和P62蛋白增加(P均<0.01),siYB-1组Beclin1和LC3Ⅱ蛋白增加,Bcl-2和P62蛋白减少(P均<0.01)。与AdGFP组相比,AdYB-1组自噬泡聚集减少,加入Bcl-2抑制剂HA14-1后自噬泡重新聚集,Beclin1蛋白恢复表达,P62降解增加,LC3Ⅱ升高。结论 YB-1可能通过上调Bcl-2、抑制Bec-lin1,实现对As2O3诱导的BGC-823细胞自噬的抑制。

核移位YB-1蛋白、P-gp及PCNA在肝癌中的表达及意义

目的探讨核移位YB-1蛋白、P糖蛋白(P-gp)、增殖核抗原(PCNA)在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及其在肝癌发生发展中的作用。方法采用免疫组化法检测YB-1、P-gp、PCNA蛋白在58例HCC组织、20例正常肝组织中的表达。结果在肝癌组织中核移位YB-1与P-gp、PCNA蛋白阳性率分别为31%(18/58)、83%(48/58)、100%(58/58),与正常肝组织相比有显著差异(P<0.05)。核移位YB-1蛋白及PCNA积分与肝癌病理分级、门静脉癌栓、肿瘤大小有关(P<0.05);P-gp蛋白与肝癌病理分级有关(P<0.05)。核移位YB-1蛋白与P-gp、PCNA蛋白表达呈正相关(P<0.05)。结论 YB-1蛋白可能通过核移位途径上调P-gp、PCNA蛋白表达,从而促进肝癌的发生发展及其恶性表型的维持,YB-1蛋白有可能成为肝癌治疗的新靶点。

YB-1对乳腺癌MCF-7细胞CD44表达和细胞侵袭及成球能力的影响

目的:观察Y-盒结合蛋白1(Y-box binding protein-1,YB-1)对乳腺癌MCF-7细胞CD44表达及细胞迁移、成球能力的影响。方法:应用基因重组技术将YB-1基因及其siRNA构建于腺病毒载体pADeasy-1,重组腺病毒及腺病毒空载体转染乳腺癌细胞株MCF-7;通过蛋白质印迹法,RT-PCR和免疫荧光的方法检测YB-1和CD44的表达;MTT法检测转染后细胞生长速度,并绘制生长曲线;并通过Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移能力;细胞使用无血清培养基培养,并加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)后,观察YB-1对细胞成球能力的影响。结果:蛋白质印迹法和RT-PCR结果显示,转染YB-1重组腺病毒载体的MCF-7细胞中,YB-1和CD44的表达明显高于转染腺病毒空载体组和未转染组;相反,转染YB-1 siRNA重组腺病毒载体的MCF-7细胞中,YB-1和CD44表达明显低于对照腺病毒空载体组和未转染组;免疫荧光也证实CD44蛋白水平与YB-1表达正相关。细胞生长曲线表明,转染YB-1重组腺病毒载体组的细胞生长速度最快,而且其侵袭、迁移和成球能力最强。结论:YB-1可能通过调控CD44的表达影响人乳腺癌细胞MCF-7的侵袭及成球能力。

靶向YB-1的microRNA表达载体的构建及其对MB-MDA-231细胞增殖的影响

目的:构建靶向YB-1基因的microRNA表达载体,研究其对乳腺癌细胞MB-MDA231增殖的影响。方法:采用microRNA靶基因预测软件预测可能作用于YB-1基因的micro RNA,构建其过表达载体,利用Lipofectamine2000转染细胞MB-MDA231,荧光显微镜下评估转染效果,real-time PCR检测microRNA137表达,real-time PCR、Western blot分别检测YB-1mRNA、蛋白水平的表达,双荧光酶素分析microRNA137作用位点,MTT检测MB-MDA231细胞转染后增殖情况;结果:酶切、测序结果表明pGensill-pre-mir137载体构建成功,real-time PCR结果表明pGensill-pre-mir137实验组细胞较对照组mir137表达明显增高(P<0.05);RT-PCR、Westernblot显示实验组转染后YB-1mRNA和蛋白水平表达较对照组均降低(P<0.05);双荧光素酶分析显示共转染microRNA137表达载体与荧光报告载体后,荧光素酶活性较对照组降低30%;MTT法检测显示转染实验组较对照组细胞增值能力降低(P<0.05)。结论:靶向YB-1基因的microRNAl37表达载体构建成功,microRNA137可通过靶向YB-1的3’非编码区,抑制MB-MDA231 YB-1基因的表达而影响其增殖。

乳腺癌中Ki-67、P53、YB-1蛋白的表达及临床意义

目的探讨Ki-67、P53和YB-1(Y-box结合蛋白)在乳腺癌组织中表达的临床意义。方法用免疫组织化学法检测2000年1月-2004年12月在解放军总医院就诊的180例乳腺癌患者YB-1蛋白表达,回顾性收集其Ki-67、P53免疫组化染色结果,分析上述3种分子的表达与临床病理特征的关系。结果 Ki-67、P53、YB-1在乳腺癌中的表达率分别为73.9%、35.0%和38.3%。Ki-67的表达与腋窝淋巴结转移数目、组织学分级、脉管癌栓、Her-2呈正相关,与ER、PR呈负相关(P<0.05);P53的表达与组织学分级、Her-2正相关(P<0.05);YB-1的核表达与Her-2正相关,与ER、PR负相关(P<0.05)。Ki-67的表达与P53正相关(r=0.380,P=0.005),也与YB-1正相关(r=0.238,P=0.023)。结论 Ki-67、P53和YB-1在乳腺癌中的表达与不良病理特征相关,是判断乳腺癌预后的重要参考指标。

人YB-1的高效原核表达及其标准蛋白与抗血清的制备

目的:构建YB1-GST表达系统,建立经济高效YB-1蛋白制备方法并制备其多抗。方法:将YB-1编码序列亚克隆至表达载体pGEX-6P-1;转化表达菌并确定可溶性表达最佳条件;采用GST亲和层析与层析柱上PSP酶切融合蛋白获取无标签蛋白的YB-1,经超滤浓缩及Western blot鉴定后,进一步真空冷冻干燥,制备YB-1标准蛋白;采用大剂量YB-1长程免疫方案免疫家兔以制备其抗体。结果:成功构建了表达载体pGEX-YB1;SDS-PAGE结果显示,YB1-GST融合蛋白以可溶性表达为主;Western blot结果证实,表达产物经GST亲和层析、PSP酶切以及真空冷冻干燥后获得了纯度较高的YB-1标准蛋白,将该蛋白免疫家兔获得了较高效价与特异性的抗体。结论:建立了YB-1-GST表达系统与经济高效的YB-1蛋白纯化方法;获得了质量较高的YB-1多抗,为进一步制备YB-1单抗、深入探讨其在肿瘤细胞中的生物学功能以及YB-1定量检测方法的建立奠定了基础。

小尾寒羊YB-1基因全长cDNA克隆与原核表达

采用RT-PCR技术从小尾寒羊睾丸组织获得YB-1基因全长cDNA,并将其编码区重组于融合表达质粒pET32a中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒在大肠杆菌BL21 plys(E)中经不同浓度IPTG诱导后获得表达,但表达量较低,且IPTG的浓度变化不影响目的蛋白的表达量。通过改变筛选抗生素,最终获得了目的融合蛋白的高效表达,为深入开展YB-1蛋白功能研究打下了良好的基础。

YB-1在青年型乳腺癌组织中的表达及意义

目的:探讨YB-1(Y-box binding protein 1)在青年型乳腺癌组织中的表达及意义。方法:应用免疫组织化学方法研究YB-1蛋白在青年型乳腺癌组织中的表达,并结合病理组织学类型、病理分级等临床特征分析YB-1在青年型乳腺癌组织中的表达意义;依据ER、PR、HER-2、CK5/6表达对青年型乳腺癌进行分子分型(Luminal-A、Luminal-B、HER2+和Basal-like 4个分子亚型),并分析其与YB-1表达的关系。结果:HE结果显示64例青年型乳腺癌病理组织学分类主要为浸润性导管癌,占59.4%。免疫组化结果显示64例青年型乳腺癌组织中YB-1阳性率为92.2%,其中细胞核阳性表达率53.1%,细胞浆阳性表达率39.1%。肿瘤>2cm的患者占59.4%,YB-1主要表达在细胞核(40.6%),患者肿瘤?2cm占37.5%,YB-1则主要在细胞浆表达(20.3%),YB-1表达类型与肿瘤大小有显著统计学意义(P=0.036)。组织学3级所占比例最高,占48.4%,且多为YB-1细胞核表达(37.5%),乳腺癌不同的组织学分级间YB-1的表达率不同(P=0.000);青年型乳腺癌患者发生淋巴结转移的比例高(84.4%),其中N3期所占比例最高,占40.6%,YB-1主要在细胞核表达,占31.3%,胞浆表达占7.8%。青年型乳腺癌分子分型中主最多见的是Luminal-B型,占46.9%,YB-1主要表达在细胞核(32.8%),浆表达仅占9.4%,统计分析显示YB-1表达的核浆分布特点与青年型乳腺癌分子分型有关(P=0.04)。结论:YB-1在青年型乳腺癌组织中的表达特点与肿瘤大小、病理组织分级及淋巴结状态有一定关系,细胞核阳性主要见于肿瘤>2cm的患者,而细胞浆阳性主要见于肿瘤?2cm的患者,且YB-1细胞核表达主要为组织学3级,且青年型乳腺癌淋巴结转移率高,YB-1主要在细胞核表达;青年型乳腺癌不同分子分型中YB-1蛋白表达存在差异,YB-1可能成为青年型乳腺癌防治的新的分子靶点。

YB-1在中晚期宫颈癌组织中的表达及其临床意义

目的研究YB-1在中晚期宫颈癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系,探讨YB-1在宫颈癌侵袭、转移和进展中的作用.方法采用免疫组化法检测中、晚期宫颈癌组织微阵列芯片78例组织标本中YB-1的表达情况,分析其表达与宫颈癌淋巴转移、FIGO分期、分化程度的关系.结果 (1)78例宫颈癌组织中YB-1的阳性表达率为24/78(30.8%);(2)YB-1在宫颈癌组织中表达与FIGO分期和分化程度密切相关,随着FIGO分期的变晚、分化程度的降低其表达逐渐增高(P<0.05);YB-1在宫颈癌组织中表达与淋巴转移无关,有淋巴转移组和无淋巴转移组YB-1表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 YB-1在宫颈癌组织中表达可能与宫颈癌的局部侵袭、转移和进展密切相关.

人类喉癌YB-1蛋白表达的临床意义

[目的]探讨人类喉癌中YB-1蛋白表达的临床意义。[方法]应用免疫组织化学方法检测了89例人类喉癌标本中YB-1蛋白的表达情况。[结果]89例人类喉癌组织中YB-1蛋白阳性率为56.2%。病理分期Ⅲ—Ⅳ期喉癌YB-1蛋白表达阳性率(76.0%)明显高于Ⅰ—Ⅱ期(48.4%)(P=0.0185)。YB-1蛋白表达与喉癌淋巴结转移密切相关(P=0.0022)。Kaplan-Meier生存曲线分析表明YB-1蛋白阳性者的术后生存率(65.5%)明显低于YB-1蛋白阴性者(86.7%)(P=0.0045)。[结论]人类喉癌标本中YB-1蛋白的检测有利于对喉癌患者的诊断、局部淋巴结转移和预后情况作出客观判断。

Twist和YB-1蛋白在宫颈鳞状细胞癌中的表达与临床意义

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,其发生率和病死率在女性恶性肿瘤仅次于乳腺癌。近年来研究发现,女性患者长期感染高危型人乳头瘤病毒（HPVs）后,一部分患者会发展为宫颈上皮内瘤变（CIN）,并由CIN发展为癌,但并非所有的CIN均发展为癌,从CIN发展为宫颈癌需经历较长时间,这是一个复杂的多步骤癌变过程。

YB-1蛋白对白血病细胞K562/A02生物学行为的影响

本研究探讨YB-1基因表达下调后对白血病细胞K562/A02生物学行为的影响及其机制。采用脂质体介导的方法将已构建的人YB-1基因特异性shRNA及随机片段HK的真核表达载体转染进白血病细胞K562/A02中,RT-PCR和免疫印迹反应检测YB-1 mRNA和蛋白表达量的改变;采用MTT法和细胞周期测定分析对白血病细胞增殖的影响;用AnnexinⅤ检测白血病细胞的凋亡程度;采用MTT法检测细胞IC50值变化;RT-PCR和流式细胞术检测基因转染前后细胞中的MDR1 mRNA和P-gp表达的变化。结果表明,阳性转染的3组细胞YB-1基因和蛋白的表达量明显低于随机片段组和未转染细胞;生长曲线提示阳性转染组细胞生长缓慢,细胞周期动力学分析显示阳性转染组G1期细胞增多,G2期与S期细胞显著减少;在小剂量As2O3作用下,阳性转染组细胞的凋亡数量明显高于对照组细胞;阳性转染细胞的阿霉素IC50明显低于随机片段组和阴性对照组;阳性转染细胞MDR1 mRNA水平明显降低,P-gp的峰值较对照组明显左移。结论:YB-1特异性shRNA能有效降低白血病细胞中YB-1的表达,减慢细胞生长,增加白血病细胞对化疗药物的敏感性,加速细胞凋亡。

核移位YB-1蛋白、P糖蛋白、增殖核抗原在肝细胞肝癌发生发展中的作用

目的探讨核移位YB-1蛋白、P糖蛋白（P-gp）、增殖核抗原（PCNA）在肝细胞肝癌组织发展中的作用。方法采用回顾性分析法,选取菏泽市立医院2014年3月~2015年6月收治的50例肝细胞肝癌患者的临床资料及组织标本,同时选取20例正常肝组织的临床标本进行分析、比较。采用免疫组织化学法检测患者YB-1、P-gp、PCNA蛋白水平表达,利用Western blot法检测肝癌组织、正常肝组织中核移位YB-1蛋白表达。结果经过分析与检测发现,在肝癌组织中P-gp、核移位YB-1、PCNA蛋白阳性率分别为83%、3l%、100%,与对照组相比,差异具有统计学意义（P〈0.05）;核移位YB-l蛋白、PCNA积分与肝癌肿瘤大小、病理分级及门静脉癌栓有紧密的关系;P-gp蛋白与肝癌病理分级有关。Western blot检测同样证实,核移位的YB-1蛋白在肝癌组织的表达显著高于正常肝组织,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论核移位YB-1蛋白、P-gp、PCNA蛋白能够促进肝细胞肝癌组织发生、发展,可能成为肝癌治疗的新靶点。

YB-1在子宫内膜异位症中的表达

目的探讨YB-1在子宫内膜异位症(EMs)患者血清及子宫内膜组织中的表达及意义,以期将YB-1作为EMs早期诊断和治疗的判定指标。方法采用ELISA法检测EMs组与对照组血清中YB-1的表达水平,采用免疫组化SP法检测两组子宫内膜组织中YB-1的表达情况。结果与对照组(9.64±2.37 ug/L)相比,EMs组患者血清YB-1的平均浓度(14.65±3.91 ug/L)较高,二者相比差异有统计学意义(p<0.05)。免疫组化结果显示YB-1在EMs组患者子宫内膜中主要呈中等强度阳性表达。正常子宫内膜中也可见YB-1的少量弱阳性表达,两组子宫内膜组织中YB-1的阳性表达率相比有明显差异(p<0.05)。结论 YB-1在EMs患者血清及子宫内膜组织中高表达,其不仅可作为EMs细胞内的标志物,也有望成为一个理想的血清学标志物。

YB-1对肿瘤增殖调控的研究进展

YB-1普遍存在于原核和真核生物细胞中，作为信号分子参与许多胞内信号传导通路，例如E2F通路、P13K／Akt／mTOR通路及MAPK通路的调节，在转录调节、翻译调控、mRNA选择性剪接、DNA的修复、细胞增殖和再生等过程中发挥多种重要的生物学功能。研究证实YB—1在前列腺癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等多种肿瘤中异常表达，且在肿瘤细胞核内异常聚集，YB-1的异常表达与肿瘤的预后相关。YB-1在肿瘤的发生、演进、转移、肿瘤细胞耐药、肿瘤治疗及预后中都发挥着极为重要的作用，下面就YB-1对细胞增殖的影响做-综述。

YB-1、ICAM-1子宫内膜癌中的表达特征及临床意义分析

目的:探究YB-1、ICAM-1子宫内膜癌中的表达特征及临床意义。方法:选取40例子宫内膜癌患者,视为A组,选取同期40例子宫内膜复杂型增生伴非典型增生患者,视为B组,选取同期40例子宫内膜单纯型增生患者,视为C组,选取同期40例体检正常女性,视为D组,对所有试验者均使用免疫组化链霉素抗生素蛋白-过氧化物法进行检测,对比三组的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)与YB-1的表达,进行统计学分析。结果:比对三组患者的阳性检测率,A组ICAM-1阳性率、YB-1阳性率均高于B组、C组与D组,组间差异呈P<0.05。B组、C组ICAM-1阳性率、YB-1阳性明显高于D组,组间差异呈P<0.05。运用Spearman相关分析,对子宫内膜癌患者中ICAM-1、YB-1的表达进行分析,统计学处理后,两者相关系数r=0.890,p=0.00,0,表示存在正相关。结论:YB-1、ICAM-1在子宫内膜癌患者中具有较高的表达,且两者之间呈正相关,可用于恶性肿瘤的诊断指标,对其治疗与预后具有重要意义。

YB-1表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的探索YB-1的表达水平对宫颈癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法免疫组化检测宫颈鳞癌组织及癌旁正常组织中YB-1的表达水平,并分析其与临床病理间的关系;慢病毒转染将YB-1过表达载体转染至宫颈癌细胞SiHa中,RT-PCR检测转染效果。CCK-8实验和克隆形成实验检测YB-1过表达后SiHa细胞增殖和克隆能力变化情况;流式细胞术检测转染后SiHa细胞周期的变化。结果相对于癌旁组织,宫颈鳞癌组织中YB-1存在明显的过表达,且与组织学分型和淋巴结转移存在明显的相关性(P<0.05);CCK-8实验发现相对于对照组,YB-1过表达的SiHa细胞株的增殖和克隆能力明显增加(P<0.05);流式细胞术检测细胞周期发现YB-1过表达的SiHa细胞比例在G1期相对减少,S期相对增多,大约90%左右的细胞停滞在G1/S期。结论宫颈癌组织中YB-1存在高表达,在非角化型癌多见且更易出现淋巴结转移。YB-1的过表达能够促进宫颈癌SiHa细胞增殖。