m^(6)A阅读者YTH蛋白的研究进展

甲基化是最为广泛存在的真核生物RNA转录后修饰形式。N6-甲基腺苷(m^(6)A)对真核生物基因转录后调控至关重要,近年来的研究揭示m^(6)A通过招募m^(6)A结合蛋白从而影响包括器官建成、肿瘤形成、节律钟调控及X染色体沉默在内的多种生物学进程。YTH蛋白是目前研究最为深入的m^6A结合蛋白,本文从YTH蛋白的分类、识别m^(6)A的分子机理及其生物学功能3个方面详尽阐述了真核生物中存在的多样化的YTH蛋白如何影响具有m^(6)A修饰的RNA的命运,以及如何调控生物体生长发育。最后,讨论了目前YTH蛋白研究仍有待解决的问题,展望了其在药物研发、作物育种等领域中的应用价值。

YTH结构域家族蛋白2和叉头蛋白转录因子3在肺腺癌中的表达关系研究

目的 分析YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)及叉头蛋白转录因子3(FOXO3)在肺腺癌病人中的表达及与预后的关系。方法 收集2020年1月至2021年5月在郑州大学第一附属医院行手术治疗的肺腺癌病人癌组织及对应的癌旁组织(距离癌组织5 cm以上)80对,收集病人临床病理资料;利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库查询YTHDF2、FOXO3基因在肺腺癌中的表达水平;采用免疫组织化学法检测YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌组织中的表达情况;分析YTHDF2、FOXO3蛋白水平与肺腺癌病人临床病理资料的关系;分析肺腺癌中YTHDF2与FOXO3基因表达水平的相关性;对病人进行为期3年的随访,分析病人3年累积生存率。结果 YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌组织中的高表达率分别为34.00%、26.00%,明显低于癌旁正常组织中79.48%、61.54%(P<0.05)。YTHDF2蛋白表达情况与肺腺癌病人年龄、淋巴结转移和分化程度相关(P<0.05);与TNM分期、性别无关(P>0.05);FOXO3蛋白表达情况与肺腺癌病人性别和分化程度相关(P<0.05);肺腺癌组织中YTHDF2蛋白高表达组和低表达组病人3年累积生存率分别为53.30%、14.00%,经log-rank比较,差异有统计学意义(P<0.05);FOXO3蛋白高表达组和低表达组病人3年累积生存率分别为64.50%、12.20%,经Log-Rank比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 YTHDF2、FOXO3在肺腺癌组织中均低表达,与病人肿瘤分化程度及3年累积生存率有关,有望成为评估肺腺癌病人预后的生物标志物。

沉默YTH结构域家族蛋白2改善血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡

目的探讨YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的新生大鼠原代心肌细胞肥大和凋亡的影响。方法为探讨AngⅡ刺激下YTHDF2的表达水平,将细胞分为正常组和AngⅡ组。为探讨沉默YTHDF2对心肌细胞肥大与凋亡的影响,将细胞分为4组,空白组[转染阴性对照小干扰RNA(siRNA)+PBS]、siYTHDF2组[转染YTHDF2 siRNA(siYTHDF2)+PBS]、模型组(siRNA+AngⅡ)和实验组(siYTHDF2+AngⅡ)。用Western blot和逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测YTHDF2基因表达水平,RT-qPCR检测心肌肥厚相关基因心房钠尿肽(ANP)、B型钠尿肽(BNP)和β肌球蛋白重链(β-MHC)及心肌细胞凋亡相关基因Bax、B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)mRNA的表达水平,免疫荧光染色观察心肌细胞表面积,原位末端标记法染色观察心肌细胞凋亡情况,免疫沉淀反应验证YTHDF2和Bcl-2的结合关系。结果AngⅡ组YTHDF2蛋白表达及mRNA水平显著高于正常组(1.49±0.03 vs 0.97±0.09,1.50±0.08 vs 1.00±0.07,P<0.05)。与空白组比较,模型组心肌细胞表面积增大,细胞凋亡率升高,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显升高,Bcl-2 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与模型组比较,实验组心肌细胞表面积减小,细胞凋亡率降低,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显降低,Bcl-2 mRNA表达明显升高(P<0.05)。结论沉默YTHDF2可以缓解AngⅡ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡,YTHDF2通过与Bcl-2相结合抑制其表达水平。

HIF-1α诱导m6A阅读蛋白YTHDF1表达对缺氧复氧诱导的小鼠心肌细胞自噬的影响

目的探究缺氧诱导因子(HIF)-1α对缺氧/复氧(H/R)诱导的小鼠心肌细胞自噬的影响及可能的作用机制。方法体外培养小鼠心肌细胞,分为对照组、H/R组、pcDNA3.1-NC组(pcDNA3.1-HIF-1α的阴性对照转染至心肌细胞)、HIF-1α过表达组(pcDNA3.1-HIF-1α转染至心肌细胞)、HIF-1α过表达+si-NC组(pcDNA3.1-HIF-1α和YTHDF1 siRNA阴性对照共转染至心肌细胞)、HIF-1α过表达+si-YTHDF1组(pcDNA3.1-HIF-1α和YTHDF1 siRNA共转染至心肌细胞),转染48 h后采用缺氧24 h复氧6 h的方法建立H/R模型。实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中HIF-1α和YTHDF1 mRNA表达;CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;试剂盒检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌钙蛋白(cTn)I、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)水平;自噬双标腺病毒mCherry-GFP-LC3B免疫荧光法检测心肌细胞自噬;Western印迹检测心肌细胞HIF-1α、YTH结构域家族蛋白(YTHDF)1及自噬相关蛋白的表达。结果与对照组相比,H/R组心肌细胞中HIF-1α和YTHDF1的mRNA和蛋白表达、自噬体和自噬溶酶体数量、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1、自噬相关蛋白2同源物A(ATG2A)、自噬相关蛋白(ATG)14表达显著增加,心肌细胞活力显著降低,细胞凋亡率、心肌细胞培养上清液中LDH、cTnI、CK-MB水平显著升高(均P<0.05);与H/R组相比,HIF-1α过表达组和HIF-1α过表达+si-NC组心肌细胞中HIF-1α和YTHDF1的mRNA和蛋白表达、自噬体和自噬溶酶体数量、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1、ATG2A、ATG14表达显著增加,心肌细胞活力显著升高,细胞凋亡率、心肌细胞培养上清液中LDH、cTnI、CK-MB水平显著降低(均P<0.05);而在HIF-1α过表达基础上使用YTHDF1 siRNA转染心肌细胞下调YTHDF1的表达后,HIF-1α过表达对心肌细胞增殖、自噬的促进作用及对细胞凋亡的抑制作用被明显减弱。结论在缺氧条件下,HIF-1α可能通过上调YTHDF1表达,促进H/R诱导的小鼠心肌细胞自噬。

m6A甲基化修饰结合蛋白YTHDF2在食管癌组织中的表达及其对食管癌细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨N6-甲基腺嘌呤(m6A)甲基化修饰结合蛋白YTH结构域连接蛋白2(YTHDF2)在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中表达及其对食管癌细胞生物学行为的影响,阐明其可能的作用机制。方法:免疫组织化学法检测113例ESCC组织和95例癌旁正常食管上皮组织中YTHDF2蛋白表达情况,分析YTHDF2蛋白表达与ESCC患者临床病理特征和预后的关系。将体外培养的食管癌Eca109和EC9706细胞分为对照组(转染si-NC)和si-YTHDF2组(分别转染si-YTHDF2#1和si-YTHDF2#2)。Western blotting法检测各组细胞中YTHDF2蛋白表达水平,CCK-8法检测各组细胞增殖能力,平板克隆实验检测各组细胞克隆形成数,Transwell小室实验检测各组细胞中迁移细胞数。结果:YTHDF2蛋白主要表达于ESCC细胞的细胞质,少量表达于细胞核,其在ESCC组织中的表达强度明显高于癌旁正常食管上皮组织(P<0.01)。不同发病年龄和TNM分期ESCC患者间YTHDF2蛋白表达强度比较差异有统计学意义(P=0.008,P=0.041)。Kaplan-Meier生存分析,与YTHDF2低表达组比较,YTHDF2高表达组ESCC患者生存率明显降低(P=0.035)。CCK-8法和平板克隆实验,与对照组比较,si-YTHDF2#1组和si-YTHDF2#2组食管癌细胞的增殖活性明显降低(P<0.05),克隆形成数明显减少(P<0.01)。Transwell小室实验,与对照组比较,si-YTHDF2#1组和si-YTHDF2#2组食管癌细胞中迁移细胞数明显减少(P<0.01)。结论:YTHDF2在ESCC组织中的表达强度明显高于正常食管上皮组织,敲低YTHDF2表达可抑制食管癌细胞的增殖、克隆形成和迁移。

YTHDF1对缺氧复氧损伤后H9c2心肌细胞凋亡及氧化应激的影响

目的探讨含YTH域家族蛋白1(YTHDF1)对缺氧复氧(H/R)条件下H9c2细胞凋亡和氧化应激的影响。方法用H9c2细胞构建H/R模型,并用YTHDF1小干扰RNA(siRNA)和过表达质粒转染细胞,采用MTT比色法测定细胞活力,并用赫斯特染色及流式细胞术测定细胞凋亡及细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和细胞培养基上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性,Western blot法测定细胞中YTHDF1、cleaved caspase-3、Bax和FasL的蛋白水平,比较对照组(control组)、H/R组、YTHDF1基因干扰和过表达组H9c2细胞凋亡和氧化损伤情况。结果H/R损伤后LDH活性和MDA含量明显升高(P<0.05),SOD活性和细胞活力显著降低(P<0.05),H/R处理后H9c2细胞中YTHDF1的蛋白水平均显著升高(P<0.05);YTHDF1干扰减轻了H/R损伤引起的形态学变化,YTHDF1过表达增加了H/R损伤引起的细胞形态变化;H/R损伤处理后cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白表达显著高于control组(P<0.05);H/R+YTHDF1-siRNA组cleaved caspase-3、Bax和FasL的蛋白水平显著低于H/R组(P<0.05),H/R+pcDNA3.1-YTHDF1组cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白水平显著高于H/R组(P<0.05)。结论下调YTHDF1可以抑制H/R处理的H9c2细胞cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白水平的上调并降低H/R处理的心肌细胞氧化损伤。

YTH结构域家族蛋白在结直肠癌中的研究进展

N^(6)-甲基腺嘌呤(m^(6)A)甲基化修饰通过调控修饰RNA广泛参与多种生物学行为,其与结直肠癌的发生、发展、预后和治疗密切相关。YTH结构域家族蛋白(YTHDF)作为研究最深入的m^(6)A阅读蛋白,通过调控甲基化的RNA影响结直肠癌的进展。部分YTHDF分子通过调控肿瘤相关通路促进结直肠癌进展,而其他YTHDF分子可能抑制结直肠癌进展,且不同研究对同一种YTHDF分子的结论也不同。未来深入研究YTHDF作为新的肿瘤标志物的潜力将为结直肠癌的诊疗提供新思路。

N^(6)-甲基腺苷结合蛋白YTHDC2在肿瘤中的研究进展

N^(6)-甲基腺苷(N^(6)-methyladenosine,m^(6)A)是真核生物RNA上最常见的可逆甲基化修饰,可影响相应RNA的加工和降解过程,进而调控细胞的生长、发育、分化和死亡等多种病理生理过程[1]。研究已明确,m^(6)A修饰是由甲基转移酶、去甲基转移酶和甲基结合蛋白(又称“redear”)共同调控的可逆修饰,其中甲基结合蛋白是m^(6)A修饰发挥生物学功能最重要的介导者[2]。

敲低YTH结构域N^6甲基腺嘌呤(m^6A)RNA结合蛋白2(YTHDF2)抑制宫颈癌细胞增殖并促进其凋亡

目的探讨敲低YTH结构域N^6甲基腺嘌呤(m^6A)RNA结合蛋白2(YTHDF2)对人宫颈癌细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法利用人蛋白图谱(Human Protein Atlas)数据库分析YTHDF2在宫颈癌中表达及与生存时间的关系。收集宫颈癌和正常宫颈组织各31例,采用免疫组织化学法检测YTHDF2的蛋白表达差异;利用敲低YTHDF2的短发夹RNA(shRNA)及空载质粒包装慢病毒,并感染至宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞,实时荧光定量PCR及Western blot法检测YTHDF2的mRNA及蛋白水平,敲低YTHDF2后,采用CCK-8法检测细胞增殖活性,集落形成实验检测细胞集落形成能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果检测数据库发现YTHDF2在宫颈癌中表达越高生存时间越短,与正常宫颈组织相比,YTHDF2在宫颈癌组织高表达。敲低YTHDF2后,抑制宫颈癌细胞增殖,促进细胞凋亡,使细胞阻滞于S期。结论YTHDF2在宫颈癌组织中高表达,敲低后抑制宫颈癌细胞增殖并促进其凋亡。

YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白F1在消化系统恶性肿瘤中的研究进展

消化系统恶性肿瘤是临床常见的恶性肿瘤,其发病原因尚未清楚。腺苷的N6位甲基化形成的N6-甲基腺苷(m6A)被认为是真核生物信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)及长链非编码RNA(lncRNA)最普遍、最丰富和最保守的内部转录修饰,在多种肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。含有YTH功能结构域的蛋白是m6A阅读器,YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白F1(YTHDF1)是其中一员,其最主要的功能是影响m6A修饰的基因翻译。本文对YTHDF1在消化系统恶性肿瘤中的研究进展进行综述。

YTHDC1介导的CENPK调节人宫颈癌细胞侵袭和增殖

目的:找寻宫颈癌的预测、治疗靶点,探究靶点与N6-甲基腺苷(m6A)核酸修饰之间的联系及发挥的生物学功能。方法:在GEPIA2数据库提供的数据中筛选宫颈癌差异表达的基因。EdU实验、划痕实验以及Transwell实验分别检测着丝粒蛋白K(CENPK)对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。RNA m6A修饰的定量测定结合蛋白质印迹法研究m6A修饰与CENPK高表达的关系。结果:CENPK在宫颈癌组织中上调(P<0.05)。沉默CENPK基因导致宫颈癌细胞增殖能力下降,抑制了细胞迁移和侵袭(P<0.01)。m6A阅读器YTH域包含蛋白1(YTHDC1)通过降低CENPK蛋白的表达在宫颈癌细胞中发挥作用(P<0.01)。结论:CENPK可能是一个潜在的宫颈癌治疗靶点。

YTHDF1对HBV蛋白表达和HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用

目的:探讨YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTHDF1)对乙型肝炎病毒(HBV)蛋白表达和抗原分泌的影响。方法:分别以pCD3/Flag-KBE和pSilencer2.1-U6 neo为载体,构建过表达和敲降YTHDF1质粒。在Huh7细胞中过表达HBV蛋白质粒的同时表达pshR-YTHDF1和对照质粒,通过Western印迹检测YTHDF1对HBV蛋白表达的影响。在HepG2.2.15细胞中过表达和敲降YTHDF1,在Huh7细胞中同时过表达pHBV1.3质粒,通过ELISA检测YTHDF1对HBsAg、HBeAg抗原分泌的影响。结果:与正常肝细胞相比,YTHDF1在肝癌细胞Huh7(t=17.4)、HepG2.2.15细胞中(t=39.6)高表达。成功构建过表达和敲降YTHDF1质粒并验证其有效。敲降YTHDF1抑制HBV基因组编码的HBc蛋白(t=9.5)、HBs蛋白(t=5.2)、preS1蛋白(t=25.7)、preS2蛋白(t=9.0)、HBx蛋白(t=19.7)、HBV DNA Pol蛋白(t=23.0)表达,差异均有统计学意义(均P<0.05)。过表达YTHDF1促进HBsAg(Huh7细胞t_(48 h)=5.5,t_(72 h)=5.0;HepG2.2.15细胞t_(48 h)=5.3,t_(72 h)=27.4)、HBeAg抗原(Huh7细胞t_(48 h)=5.7,t_(72 h)=6.3;HepG2.2.15细胞t_(48 h)=29.0,t_(72 h)=6.6)的分泌,而敲降YTHDF1抑制HBsAg(Huh7细胞t_(48 h)=16.0,t_(72 h)=7.9;HepG2.2.15细胞t_(48 h)=22.3,t_(72 h)=7.0)、HBeAg抗原(Huh7细胞t_(48 h)=9.0,t_(72 h)=14.3;HepG2.2.15细胞t_(48 h)=8.1,t_(72 h)=6.6)的分泌(均P<0.05)。结论:YTHDF1可能具有增加HBV蛋白表达及促进HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用。

YTHDC1介导ABCB6上调诱导AD小鼠神经元细胞铁死亡促进认知功能障碍机制的实验研究

目的研究ATP结合盒B亚家族转运蛋白6(ATP-binding cassette subfamily B transporter 6,ABCB6)对阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)小鼠认知功能障碍的影响及其可能的潜在调控分子机制。方法通过注射β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)构建体内AD小鼠模型;采用水迷宫测试和Y迷宫测试评估大鼠学习与记忆能力、空间探索能力。通过神经元HT22细胞和Aβ构建体外AD细胞模型;采用RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)分析YTH结构域包含蛋白1(YTH domain containing proteins 1,YTHDC1)与ABCB6的结合关系;实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测过表达和敲低转染效率;Western blot检测YTHDC1和ABCB6蛋白,以及铁死亡相关蛋白[溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)]表达水平;CCK-8检测细胞活力;检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平及Fe^(2+)含量。结果AD小鼠海马组织及Aβ诱导的HT22细胞中ABCB6 mRNA(3.51±0.17 vs 1.02±0.01,3.45±0.21 vs 1.02±0.01)和蛋白(3.25±0.14 vs 1.01±0.01,3.14±0.16vs 1.01±0.01)水平均显著上调,差异具有统计学意义(t=-46.238,-20.349;-50.468,-23.013,均P<0.001)。敲低ABCB6显著降低AD小鼠抵达平台的时间、到达平台距离,增加小鼠自发交替率和进入新异臂次数的比值(t=27.007,11.264,24.414,19.901,均P<0.001)。敲低ABCB6促进HT22细胞增殖,抑制Aβ诱导的MDA,Fe^(2+)水平上调和GSH水平下调,减少ROS生成,促进SLC7A11和GPX4蛋白表达(t=2.883~26.122,均P<0.05)。YTHDC1蛋白通过与ABCB6 mRNA结合促进其稳定性,上调ABCB6蛋白表达。敲低YTHDC1显著降低ABCB6蛋白水平(t=18.504,P<0.001),促进HT22细胞增殖,升高GSH含量及SLC7A11和GPX4蛋白水平,降低MDA和Fe^(2+)含量,抑制ROS生成(t=4.404~14.486,均P<0.05)。敲低YTHDC1可以改善AD小鼠学习与记忆能力和空间探索能力。过表达ABCB6可逆转敲低YTHDC1对HT22细胞铁死亡和AD小鼠认知功能障碍的影响。结论YTHDC1可能通过介导ABCB6上调,诱导神经元细胞铁死亡,进而促进AD小鼠的认知功能障碍发生。

YTHDF3与肿瘤转移关系的研究进展

转移的发生是晚期肿瘤患者死亡的重要原因,筛选合适的肿瘤转移标志物对于转移的预测、疗效检测和预后评估至关重要。YTH结构域家族蛋白(YTHDF)3属于YTHDF,也是N^(6)-甲基腺苷重要的调节蛋白,定位于真核生物细胞质中并参与表观遗传调控,与细胞增殖、分化、代谢以及肿瘤发生有关。此外,YTHDF3还可参与肿瘤的发生、转移以及上皮-间充质转化等过程,是肿瘤发生转移的重要因素之一,有望成为肿瘤转移重要的生物标志物。

YTH基因家族在肾癌中的表达和预后价值

目的生物信息学分析YTH基因家族各成员在肾癌中的表达及功能。方法利用UALCAN、Kaplan-Meierplotter、cBioPortal、WebGestalt、GEPIA2、cBioPortal数据平台对YTH家族分子在肾癌患者中的表达差异、预后价值、基因改变、功能富集、免疫浸润相关性、甲基化进行生物信息学分析。结果肾癌中YTHDF2、YTHDF3和YTHDC1 mRNA表达均较正常肾组织明显下降,YTHDC2则较正常肾组织明显升高。YTHDF2和YTHDF3的低表达患者总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)明显低于高表达患者。YTHDC2基因变异率为最高(占11%),主要遗传变异类型为基因扩增。富集分析显示YTH基因家族相关功能包括生物合成、分解及代谢。相关的信号通路有转化启动,mRNA代谢调控好喝基因表达转录调控等。YTH家族多数成员的表达与CD_(4)^(+)T,CD_(8)^(+)T细胞、内皮细胞的浸润呈显著性正相关,与巨噬细胞浸润呈负相关。YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1在肾癌中的甲基化水平较正常肾组织中显著升高,YTHDC2甲基化水平则下降。结论YTH家族成员在肾癌中存在表达及功能差异。YTH相关基因特别是YTHDF2、YTHDF3分子可能成为肾癌诊断和预后评估的潜在的标志物。

乳腺癌组织中YTHDF1、USP28的表达及临床意义

目的探讨乳腺癌组织中YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTHDF1)、泛素特异性蛋白酶28(USP28)的表达及意义。方法选取乳腺癌患者103例,应用实时荧光定量PCR法及免疫组化法检测癌组织和癌旁正常组织中YTHDF1、USP28 mRNA和蛋白表达。Spearman秩相关分析法分析YTHDF1、USP28蛋白表达的相关性。比较不同临床病理特征患者癌组织中YTHDF1、USP28蛋白阳性表达率差异。Kaplan-Meier生存分析(Log-Rank检验)法分析YTHDF1、USP28蛋白表达与患者临床预后的关系。单因素及多因素Cox回归分析影响乳腺癌患者临床预后的因素。结果乳腺癌组织中YTHDF1、USP28 mRNA及蛋白表达均高于癌旁正常组织(P均<0.05)。乳腺癌组织中YTHDF1蛋白表达与USP28蛋白表达呈正相关(r=0.613,P<0.05)。不同TNM分期、分化程度癌组织中YTHDF1、USP28蛋白阳性表达率比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。YTHDF1阳性表达及阴性表达者3年总体生存率分别为77.14%(54/70)、90.91%(30/33),差异有统计学意义(P<0.05)。USP28阳性表达及阴性表达者3年总体生存率分别为76.71%(56/73)、90.91%(28/30),差异有统计学意义(P<0.05)。YTHDF1阳性表达、USP28阳性表达、TNM分期Ⅲ期、低分化程度是影响乳腺癌患者临床预后的独立危险因素(P均<0.05)。结论乳腺癌组织中YTHDF1、USP28表达升高,二者与TNM分期、分化程度有关,是影响乳腺癌患者临床预后的独立危险因素。

N6-腺苷酸甲基化结合蛋白的遗传变异与胃癌风险关联分析

目的探讨YTHDF1 rs6011668、HNRNPA2B1 rs2070601和rs76558212的单核苷酸多态性(SNPs)与胃癌风险关联。方法收集胃癌病例457例,健康对照525例,采用结合多重PCR和高通量测序的Hi-SNP的基因分型方法对YTHDF1 rs6011668、HNRNPA2B1 rs2070601和rs76558212进行基因分型;使用χ^(2)检验和logistic回归分析SNPs与胃癌发病风险和临床进展的关联,使用多因素logistic回归和Risk Score(RS)模型综合分析环境和遗传因素对胃癌发病的影响。结果YTHDF1 rs6011668 TT基因型携带者的胃癌发病风险是CC基因型携带者的3.075倍(95%CI:1.128~8.382,P=0.028),是CC/TC基因型携带者2.961倍(95%CI:1.091~8.033,P=0.033);分层分析发现,TT基因型主要增加不饮茶者、吃腌制食物者和吃油炸食物者的胃癌发病风险(P<0.05);此外,TT基因型携带者增加胃癌浸润程度、淋巴结转移、远端转移和中晚期风险(P<0.05)。综合环境与遗传因素,计算病例组和对照组的风险评分(RS),以RS四分位数分组发现,RS得分越高,胃癌发病风险越高。与RS≤Q25组相比,Q25≤RS<Q50组、Q50<RS<Q75组和RS≥Q75组胃癌的发病风险分别为3.090、9.731和19.949。结论YTHDF1 rs6011668突变基因型可能与增加胃癌发病风险和推进临床进展有关,结合环境与遗传因素能更好地评估胃癌的发病风险。

敲低MGC-803胃癌细胞YTHDF2抑制其增殖并促进其凋亡

目的研究敲低YTH结构域N^6甲基腺嘌呤(m^6A)RNA结合蛋白2(YTHDF2)对MGC-803人胃癌细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法用UCSC Cancer Browser下载癌症基因组图谱(TCGA)数据库筛查YTHDF2 mRNA在胃癌中的表达情况。设计并构建能够靶向敲低YTHDF2的短发夹RNA(shRNA)病毒载体;病毒感染MGC-803细胞,敲低YTHDF2水平后,实时荧光定量PCR检测YTHDF2 mRNA水平,Western blot法检测YTHDF2蛋白水平,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果通过TCGA数据库查询发现YTHDF2在胃癌组织中高表达。成功构建YTHDF2敲低的稳定转染MGC-803细胞。与对照组相比,YTHDF2敲低后,明显抑制细胞增殖;G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少;细胞凋亡率升高。结论敲低MGC-803胃癌细胞YTHDF2水平,抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡。

m^(6)A甲基化修饰酶YTHDF3对食管鳞癌细胞增殖和迁移的影响及机制

目的:研究N6–甲基腺嘌呤(m^(6)A)甲基化修饰酶YTH域家族蛋白3(YTHDF3)对人食管癌细胞(Ec109)增殖及迁移的影响及其机制。方法:选择食管癌患者为研究对象,取肿瘤组织及癌旁组织检测YTHDF3基因信使核糖核酸(mRNA)和蛋白表达。设计合成YTHDF3过表达质粒(pcDNA–YTHDF3)、空载质粒(pcDNA)、干扰表达质粒(si–YTHDF3)及对照(si–NC)转染至Ec109细胞。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT–PCR)检测YTHDF3、大肿瘤抑制基因1(LAST1)、锚定蛋白重复域蛋白1(ANKRD1)、半胱氨酸丰富血管生成诱导因子61(CYR61)、结缔组织生长因子(CTGF)基因mRNA表达;蛋白质印迹法检测YTHDF3基因蛋白表达;MTT法检测细胞增殖活力;Transwell检测细胞迁移。Kaplan–Meier法比较YTHDF3与生存期的关系。结果:转染si–YTHDF3后Ec109细胞YTHDF3及LAST1基因mRNA和蛋白表达、靶基因ANKRD1、CYR61及CTGF的m RNA表达显著降低,细胞增殖及迁移显著增加,差异有统计学意义(P <0.05)。转染pcDNA–YTHDF3后Ec109细胞YTHDF3及LAST1基因mRNA和蛋白表达、靶基因ANKRD1、CYR61及CTGF的m RNA表达显著升高,细胞增殖及迁移显著降低,差异有统计学意义(P <0.05)。食管鳞癌患者肿瘤组织中YTHDF3基因mRNA及蛋白表达均显著低于癌旁组织,差异有统计学意义(P <0.05)。YTHDF3基因高表达患者中位生存期显著高于YTHDF3基因低表达组患者,差异有统计学意义(P <0.05)。结论:YTHDF3基因可抑制食管鳞癌细胞增殖及迁移,其机制可能与调控LAST1基因表达有关。

基于CRISPR-Cas9系统敲除YTHDF2对子宫颈癌HeLa细胞生物学行为影响的研究

目的:探讨使用CRISPR-Cas9系统敲除YTH结构域m6A RNA结合蛋白2(YTHDF2)后对子宫颈癌HeLa细胞生物学行为的影响。方法:培养子宫颈癌HeLa细胞,使用CRISPR-Cas9系统构建YTHDF2敲除细胞系;分为对照组、敲除1组和敲除2组,行克隆形成实验、CCK8实验、裸鼠移植瘤模型分析YTHDF2在体内、体外增殖中的作用,RNA测序探讨作用机制。结果:双sgRNA片段敲除策略成功敲除YTHDF2,敲除1组、敲除2组增殖曲线明显低于对照组,表现为时间依赖性,与对照组相比,敲除1组、敲除2组的HeLa细胞增殖能力显著下降,细胞克隆形成数明显降低,皮下移植瘤质量明显减小,差异均有统计学意义(P<0.001);RNA水平负调控细胞周期G2/M期转换的基因集上调,细胞黏附分子基因集下调,Ras和Wnt信号通路下调,差异均有统计学意义(FDR<0.05)。结论:敲除YTHDF2通过上调负调控细胞周期G2/M期转换的基因,抑制子宫颈癌细胞增殖、克隆形成及皮下成瘤能力。