YVAD-cmK及DEVD-CHO对培养的人视网膜色素上皮细胞光损伤的影响

目的 观察半胱天冬酶(caspase-3)选择性抑制剂天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酰胺醛(Asp-Glu-Val-Asp-CHO,DEVD-CHO),及caspase-1选择性抑制剂酪氨酸-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酰胺(Tyr-Val-Ala-Asp-cmK,YVAD-cmK)对可见光诱导的培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡的影响。方法 用(2000±500)lx的白色荧光灯光源,照射培养的人RPE细胞。在培养液中加入YVAD-cmK和DEVD-CHO,利用荧光素标记的连接素V/碘化丙锭双染色流式细胞测定观察RPE细胞的凋亡情况。结果 本研究模型下,DEVD-CHO预处理组的细胞凋亡及坏死与无光照组相比,差异无显著性(P>0.05),与光照组及YVAD-cmK预处理组相比,细胞存活数增高,差异有显著性(P<0.05)。而YVAD-cmK组与无光照组比较,其结果与单纯光照组一样,表现出细胞的明显损伤(P<0.05)。结论 可见光诱导培养的人RPE细胞凋亡的发生机制中,可能不涉及casrpase-1的作用。外源性的caspase-3抑制剂(DEVD-CHO)对RPE细胞光性损伤有一定的保护作用。

Caspase1抑制剂Ac-YVAD-CMK在防治小鼠急性移植物抗宿主病中的作用

目的:探讨阻断Caspase1对小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响及其作用机制。方法:用Caspase1特异性抑制剂Ac-YVAD-CMK阻断Caspase1活化。实验小鼠分为异基因造血干细胞移植联合脾细胞输注(TS组,n=12)、TS+低剂量Caspase1抑制剂(TS+C低组,n=16)和TS+高剂量Caspase1抑制剂(TS+C高组,n=19)共3组。检测各组小鼠体重变化,观察小鼠GVHD临床评分;应用HE染色观察GVHD靶器官的(肝脏、肺、结肠、皮肤)病理学改变,并作病理评分;流式细胞术检测外周血中Th1、Th2和Th17细胞的比例;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组小鼠血浆中IL-1β、IFN-γ、IL-1α、IL-18水平。结果:AC-YVAD-CMK能减轻小鼠aGVHD:与TS组相比,TS+C低组和TS+C高组的aGVHD严重程度明显减轻(P<0.05);通过检测各组小鼠外周血Th细胞亚群发现,与TS组相比,TS+C低组和TS+C高组的Th1细胞比例明显减少(P<0.05),Th2和Th17细胞比例明显增多(P<0.05);ELISA检测小鼠外周血IL-1β、IFN-γ、IL-18和IL-1α显示,TS+C高组和TS+C低组与TS组相比,上述4种炎症因子水平均明显降低(P<0.05)。结论:Ac-YVAD-CMK通过抑制Caspase1活化,减少炎症性介质释放,从而减轻aGVH临床症状和病理损伤。

Caspase-1抑制剂对大鼠急性痛风性关节炎的作用

目的研究Caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK对尿酸钠晶体诱导大鼠急性痛风性关节炎（GA）的作用。方法选用健康雄性Wistar大鼠50只,按随机区组法将大鼠分为5组：空白对照组（A组）,模型组（B组）,秋水仙碱组（C组）,低剂量AC-YVAD-CMK组（D组）,高剂量AC-YVAD-CMK组（E组）,每组10只。采用尿酸钠晶体制备大鼠GA模型,造模后给药3 d,A、B组给予生理盐水,C组给予秋水仙碱,D、E组给予不同剂量AC-YVAD-CMK。用皮尺测定造模后2、4、6、8、24、487、2 h大鼠的踝关节周径;造模后72 h,麻醉后心脏取血,生理盐水冲洗关节腔,行白细胞计数;采用放射免疫分析法测定大鼠关节冲洗液及血清中白细胞介素1β（IL-1β）的水平;以苏木精-伊红染色观察大鼠关节滑膜的病理学改变。结果造模后72 h,AC-YVAD-CMK能显著降低GA模型大鼠的踝关节肿胀度及关节冲洗液、血液白细胞水平（F=10.34-44.66,P〈0.01）。放射免疫分析检测结果显示,AC-YVAD-CMK可显著降低GA大鼠关节冲洗液及血清中IL-1β的水平（F=4.34、4.49,P〈0.01）。病理组织学检查结果显示,AC-YVAD-CMK可减轻GA模型大鼠踝关节滑膜增生,减少关节组织炎性细胞浸润。结论AC-YVAD-CMK对尿酸钠晶体诱导大鼠GA有显著的改善作用,其机制可能与降低IL-1β水平有关。

抑制NLRP3炎症小体中Caspase-1活化对大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生的保护作用

【目的】研究Caspase-1特异性抑制剂AC-YVAD-CMK对大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生的影响及可能机制。【方法】33只雄性成年SD大鼠,随机均分为假手术组、球囊损伤组、球囊损伤+AC-YVAD-CMK组。采用球囊损伤大鼠颈动脉的方法建立血管内膜增生动物模型,14天后留取球囊损伤段血管,15个血管片段制作冰冻切片,苏木精-伊红(HE)染色法测量内膜与中膜(I/M)面积比值;18根血管片段采用Western blot检测NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体、cleaved-Caspase-1、白介素(IL)-1β和IL-18的表达。【结果】HE染色发现,AC-YVAD-CMK显著抑制了内膜增生的程度(0.78±0.13 vs 1.52±0.14,P=0.000)。Western blot结果提示球囊损伤+AC-YVAD-CMK组中NLRP3蛋白表达较球囊损伤组显著降低(P=0.009);cleaved-Caspase-1蛋白在三组中的表达趋势与NLRP3蛋白表达一致(P=0.000)。且球囊损伤+AC-YVAD-CMK组大鼠的促炎性细胞因子IL-1β和IL-18水平较球囊损伤组显著降低(P=0.000)。【结论】AC-YVAD-CMK可以抑制大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生,其机制可能是其阻断Caspase-1蛋白活化,从而抑制促炎因子IL-1β和IL-18的释放而产生一定的保护作用。

细胞焦亡在急性CO中毒迟发性脑病中的作用机制研究

目的:对细胞焦亡参与的急性一氧化碳(CO)中毒迟发性脑病(DEACMP)的作用机制进行研究。方法:将经过Morris水迷宫筛选后的120只SD大鼠随机分为空气组(K组)、CO中毒组(CO组)、CO+Ac-YVAD-cmk组(cmk组)。各组再按照时间顺序随机分为1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 5个亚组。Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力损伤情况,Western blot检测NLRP3、cleaved-caspase-1、GSDMD蛋白的动态表达,免疫组化检测caspase-1阳性细胞表达,ELISA检测成熟IL-1β和IL-18表达。结果:染毒后第14天及第21天,CO组及cmk组较K组逃避潜伏期延长、穿越平台次数减少(P<0.05)。中毒后各时间点CO组及cmk组中NLRP3、cleaved-caspase-1及GSDMD蛋白具有相似的表达趋势,均于染毒第3天及第14天出现峰值(P<0.05)。CO组及cmk组caspase-1阳性细胞数在染毒第14天均达到峰值,且两组IL-1β及IL-18蛋白水平均在染毒第14天表达最为显著。结论:细胞焦亡参与了大鼠DEACMP的发生,二者具有时间依赖性,抑制细胞焦亡有利于减轻CO中毒后大鼠认知功能的损伤。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织中的作用

目的探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病中的作用。方法用脂多糖+香烟烟熏法建立大鼠COPD模型。将模型大鼠随机分为模型组和实验组,每组12只;另取12只正常大鼠作为对照组。对照组于第2~13和15~30天腹腔注射等量的0.9%NaCl;模型组于每次烟熏前腹腔注射等量的0.9%NaCl;实验组在每次烟熏前按10 mg·kg^-1的剂量腹腔注射1 mg·mL^-1 AC-YVAD-CMK。用强迫震荡式小动物肺功能检测仪测量肺总量、肺顺应性和呼吸阻力,用免疫组化法检测NLRP3的表达水平。结果实验组、对照组和模型组的顺应性分别为(0.62±0.13),(0.68±0.21)和(0.43±0.13)mL·cm^-1 H2O,呼吸阻力分别为(0.07±0.02),(0.05±0.02)和(0.14±0.01)cm·H2 O·s·mL^-1,肺总量分别为(10.07±1.30),(10.09±2.51)和(7.71±1.79)mL,细支气管平滑肌厚度分别为(14.66±0.95),(10.84±0.97)和(19.69±1.90)μm^2·μm^-1,NLRP3表达水平分别为(44.26±6.77)×103,(15.93±2.89)×10^3和(103.02±18.91)×10^3,实验组和对照组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论COPD大鼠肺组织内NLRP3表达水平增高,阻断NLRP3炎性小体通路可作为防治COPD的方法。