益肾养髓方对脊髓型颈椎病大鼠脊髓中神经营养因子表达的影响及其神经修复作用研究

背景骨关节退行性改变压迫脊髓所致的脊髓型颈椎病(CSM)与脊髓急性损伤在病理特点及治疗策略方面存在差异,中医药治疗退行性CSM有着独特优势,临床应用广泛,但脊髓慢性压迫相关的治疗机制研究较少。目的研究益肾养髓方对脊髓慢性压迫大鼠脊髓(C_(5~7))神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT3)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的mRNA表达水平影响及NGF的蛋白表达和分布情况,探讨益肾养髓方促进CSM神经功能修复的作用机制。方法2019年1月选取SPF级雌性SD大鼠96只,其中72只大鼠采用吸水膨胀材料聚乙烯醇丙烯酰胺互穿网络水凝胶(由北京师范大学化学学院提供)压迫脊髓的方法进行造模,余24只大鼠假手术(假手术组)。造模成功的大鼠随机分为模型组(n=24)、中药高浓度组(n=16)、中药中浓度组(n=16)、中药低浓度组(n=16)。中药灌胃的各组按照对应浓度进行灌胃(大鼠灌胃给药剂量采用体表面积系数换算系数6.3计算,高浓度为16.74 g·kg^(-1)·d^(-1)、中浓度为8.37 g·kg^(-1)·d^(-1)、低浓度为4.19 g·kg^(-1)·d^(-1)),药液浓缩后以1 ml/100 g体积灌胃给药,模型组及假手术组灌服等量(1 ml/100 g)0.9%氯化钠注射液,1次/d。分别于术后2、4、6、8、10周时,评价各组大鼠运动功能指数评分(BBB评分);术后2、6、10周时,尼氏染色法观察大鼠脊髓前角正常神经元的尼氏体分布,实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测大鼠脊髓营养因子NGF、NT3、GDNF的mRNA表达水平、免疫组织化学分析NGF脊髓前角区蛋白表达及分布情况。结果(1)术后2周,假手术组BBB评分高于模型组、中药高浓度组、中药中浓度组和中药低浓度组(P<0.05);术后4周,假手术组BBB评分高于模型组、中药高浓度组、中药中浓度组和中药低浓度组(P<0.05);术后6周,假手术组BBB评分高于模型组、中药高浓度组、中药中浓度组和中药低浓度组(P<0.05),模型组BBB评分低于中药高浓度组(P<0.05),中药高浓度组BBB评分高于中药中、低浓度组(P<0.05);术后8周,假手术组BBB评分高于模型组、中药高浓度组、中药中浓度组和中药低浓度组(P<0.05),模型组BBB评分低于中药高浓度组(P<0.05),中药高浓度组BBB评分高于中药中、低浓度组(P<0.05);术后10周,假手术组BBB评分高于模型组、中药高浓度组、中药中浓度组和中药低浓度组(P<0.05),模型组BBB评分低于中药高、中浓度组(P<0.05),中药高浓度组BBB评分高于中药中、低浓度组(P<0.05)。(2)术后2周,假手术组脊髓前角运动神经元形态正常,可见大量虎斑状尼氏体,丰富饱满;模型组脊髓前角神经元细小,形态为圆形,分布稀疏,胞内尼氏体溶解减少甚至消失;在术后6、10周时,中药高、中浓度组神经元虽有一定程度损伤,但细胞形态丰满、可见细胞内虎斑状尼氏体;中药低浓度组可见少量空泡,神经元细胞分布略稀疏,单个细胞内尼氏体数目比中药高、中浓度组含量少。术后2周,假手术组正常神经元数目多于模型组(P<0.05)。术后6周,假手术组正常神经元数目多于模型组、中药中浓度组和中药低浓度组(P<0.05),模型组正常神经元数目少于中药高浓度组(P<0.05),中药高浓度组正常神经元数目多于中药低浓度组(P<0.05)。术后10周,假手术组正常神经元数目多于模型组、中药低浓度组(P<0.05),模型组正常神经元数目少于中药高浓度组(P<0.05)。(3)术后6周,中药高浓度组NGF mRNA表达水平高于假手术组、模型组和中药低浓度组(P<0.05),中药高浓度组NT3 mRNA表达水平高于模型组(P<0.05),中药高浓度组GDNF mRNA表达水平高于假手术组、模型组和中药中、低浓度组(P<0.05)。(4)假手术组和模型组中脊髓前角的神经元细胞NGF染色程度较浅,分布稀疏,中药高、中浓度组大鼠的脊髓前角神经元NGF染色较明显,细胞形态完整。术后6周,中药高浓度组NGF平均积分光密度值高于假手术组和模型组(P<0.05)。结论益肾养髓方可能通过增加脊髓中NGF、NT3、GDNF的mRNA表达水平,改善CSM大鼠的四肢运动功能,保护脊髓前角中正常运动神经元,从而达到促进神经修复的效果。

益肾养髓方对脊髓型颈椎病大鼠脊髓中星形胶质细胞过度增殖的影响

目的观察益肾养髓方对脊髓慢性压迫大鼠脊髓(C;~C;)中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)mRNA表达量及GFAP蛋白表达和分布的影响,以探讨益肾养髓方对脊髓型颈椎病(Cervical Spondylotic Myelopathy,CSM)大鼠脊髓中星形胶质细胞过度增殖和胶质瘢痕形成的作用。方法将56只健康雌性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、阳性对照组及益肾养髓方低、中、高剂量组,每组8只。模型组、益肾养髓方各剂量组及阳性对照组大鼠采用吸水膨胀材料压迫脊髓建立脊髓型颈椎病大鼠模型,假手术组仅手术暴露脊髓。手术后2周,益肾养髓方不同剂量组采用中药水煎剂灌胃,阳性对照组采用单唾液酸四己糖神经节甘脂钠肌注,其余组采用生理盐水灌胃,每日1次,连续4周。于给药后第1、3、7、14、21、28天进行大鼠运动功能评价(BBB评分)。术后6周时HE染色观察脊髓组织结构,RT-qPCR法检测大鼠脊髓GFAP的mRNA表达,免疫荧光观察GFAP蛋白表达。结果灌胃后益肾养髓方各组及阳性对照组大鼠BBB评分明显高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05),说明益肾养髓方对改善脊髓型颈椎病大鼠脊髓功能有一定疗效。HE染色益肾养髓方各组及阳性对照组可见脊髓组织中瘢痕、空洞变少,胞浆逐渐增多,神经细胞形态接近假手术组。RT-qPCR及免疫荧光结果提示模型组GFAP mRNA及蛋白表达升高(P<0.05),益肾养髓方各组及阳性对照组可降低其表达,与模型组比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论益肾养髓方可降低脊髓慢性压迫性损伤大鼠脊髓中GFAP的表达,从而减少胶质瘢痕的形成,促进大鼠后肢运动功能恢复。

益肾养髓方治疗脊髓型颈椎病的量效关系研究

目的:探讨益肾养髓方治疗脊髓型颈椎病(CSM)的量效关系。方法:首先建立CSM动物模型,建模成功大鼠随机分为模型组、益肾养髓方7个浓度梯度组(0.84,1.49,2.65,4.71,8.37,14.88,26.46 g·kg^(-1)),每组4只,另取4只作为假手术组。连续灌胃给药8周后,全部动物进行脊髓功能测定并处死,采用HE染色、尼氏体染色、免疫组化染色等方法,以Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评分及受损脊髓中脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、Fas、FasL、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)等的蛋白表达作为评价指标,初步探讨益肾养髓方治疗CSM的半数有效剂量(ED_(50)),确定方剂量效。结果:与模型组相比,益肾养髓方灌胃后可以改善大鼠的脊髓运动功能,BBB评分从浓度4.71 g·kg^(-1)开始差异有统计学意义(P<0.05);同时可以在一定程度上改善大鼠的脊髓形态,增加神经元细胞内尼氏体的数量,BDNF、Caspase3、NGF的表达从浓度2.65 g·kg^(-1)开始差异有统计学意义(P<0.05),FAS、FASL表达从浓度1.49 g·kg^(-1)开始差异有统计学意义(P<0.05)。益肾养髓方各给药组治疗CSM具有剂量依赖趋势,治疗CSM的ED_(50)为9.1 g·kg^(-1)。结论:益肾养髓方对慢性脊髓压迫大鼠具有较好的治疗效果,并可在一定程度上促进受损神经元细胞的修复。

益肾养髓方对脊髓型颈椎病大鼠脊髓中细胞凋亡的影响

目的:观察益肾养髓方对脊髓型颈椎病大鼠脊髓中细胞凋亡及Fas/FasL-Caspase-8/-3通路的影响。方法:将大鼠随机分配至假手术组、模型组及益肾养髓方高、中、低浓度组,采用吸水膨胀材料压迫脊髓的方法建立脊髓型颈椎病动物模型,术后2周分别给予生理盐水或相应中药水煎剂灌胃。采用Basso Beatie Bresmahan(BBB)评分法测量大鼠运动功能,TUNEL染色评估细胞凋亡,RT-qPCR和Western Blot检测Fas、FasL、Caspase-8及Caspase-3表达情况。结果:造模术后2周,益肾养髓方各组及模型组BBB评分显著低于假手术组(P<0.05)。术后6周,益肾养髓方中浓度组BBB评分均显著优于模型组(P<0.05)。TUNEL染色显示,益肾养髓方各组细胞凋亡率均显著低于模型组(P<0.05)。术后6周,RT-qPCR检测显示,益肾养髓方高、中、低浓度组Caspase-3 mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05),中、低浓度组Caspase-8 mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05),高、中浓度组Fas mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05),低浓度组FasL mRNA表达水平低于模型组(P<0.05)。Western Blot检测显示,益肾养髓方高、中、低浓度组Caspase-3蛋白相对表达量低于模型组(P<0.05),益肾养髓方中浓度组Caspase-8蛋白相对表达量低于模型组(P<0.05),中、低浓度组Fas及FasL蛋白相对表达量低于模型组(P<0.05)。结论:益肾养髓方可通过抑制Fas/FasL-Caspase-8/-3信号通路减少受损脊髓区域的细胞凋亡,进而改善脊髓型颈椎病。

益肾养髓方对脊髓型颈椎病大鼠小胶质细胞极化的影响

目的:观察益肾养髓方对慢性脊髓压迫大鼠模型受压脊髓组织小胶质细胞极化的影响。方法:50只Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组、模型组、益肾养髓方高、中、低剂量组,采用吸水膨胀材料压迫脊髓的方法进行造模,给药后分别通过斜板试验、苏木精-伊红(HE)染色、蛋白质印迹(Western Blot)法检测、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)评价大鼠的运动功能与CD86、CD206蛋白及IL-18、IL-1βmRNA的表达。结果:各时间节点的中药灌胃组、模型组斜板试验结果与假手术组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。中药中、高剂量组斜板试验结果均优于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);HE染色可见假手术组神经元细胞形态基本正常,模型组大量神经元细胞受损,细胞肿胀坏死,给药组神经元空泡样改变减少,细胞形态及数量有一定恢复。Western Blot法检测结果显示:与假手术组比较,模型组、中药各给药组CD86蛋白表达均高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05);中药中、高剂量组CD206表达高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。中药中、高剂量组CD86/CD206低于假手术组和模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-qPCR结果显示:中药中、高剂量组IL-18表达低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);中药中、高剂量组IL-1β表达低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:益肾养髓方可促使脊髓组织中M1型小胶质细胞向M2型分化,减轻脊髓受压时炎症反应,在一定程度上改善大鼠运动功能。

益肾养髓方对脊髓型颈椎病大鼠线粒体自噬及血脊髓屏障功能的影响

目的:观察益肾养髓方对脊髓型颈椎病大鼠血脊髓屏障(BSCB)及其中线粒体自噬的影响。方法:27只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、益肾养髓方组,每组9只。采用吸水膨胀材料构建大鼠脊髓慢性受压模型。利用BBB评分、伊文思蓝(EB)染色、荧光显微镜观察、免疫荧光多重标记法和Western blot等技术,评估大鼠的运动功能、BSCB通透性、内皮细胞损伤和线粒体自噬的变化。结果:与模型组比较,益肾养髓方组大鼠在第3、7、14天BBB评分显著升高(P<0.05)。模型组大量神经元细胞受损,而益肾养髓方组神经元形态和数量有一定恢复趋势。益肾养髓方组Claudin-5、ZO-1、Occludin蛋白较模型组表达水平显著升高(P<0.01),EB渗出量显著下降(P<0.05)。益肾养髓方组LC3标记的自噬小体与Hsp60标记的线粒体有共定位信号(P<0.05),且LC3和Hsp60的荧光标记数量较模型组更多(P<0.05)。结论:益肾养髓方能显著调控线粒体自噬功能,减轻线粒体受损的程度,并有效缓解大鼠BSCB的损伤。