Study on the Effect of Youguiyin(右归饮) on Regulating Gene Expression Profile of the Rats with Femoral Head Necrosis Induced by Steroid

Objective： To observe the regulation of Youguiyin （YGY, 右归钦） on the gene expression profile of the rat with steroid-induced femoral head necrosis （sFHN）, for the sake of investigating its molecular mechanism of sFHN prevention and treatment. Methods： All the 30 rats were randomly divided into three groups, the normal control group （A）, the model control group （B）, and the YGY treated group （C）, 10 in each group. After rats in Groups B and C were being made into FHN models with steroid injection, they received a daily intragastdc administration of saline and YGY respectively in equal volume for a total of 6 weeks, while to the unmodeled normal rats in Group A, saline was administered instead. The rats were sacrificed at the terminal of administration; their mRNA from femoral head tissue was extracted and prepared to cDNA probe through inverse transcription for detecting gene expression profile by microarray, outcomes of which was passing fluorescence quantitative PCR verification, and the differential expressed genes were analyzed adopting gene ontology （GO） method. Results： Compared with Group A, the numbers of differential genes found in Groups B and C were 190 and 92, respectively, but the changing trend in the two groups was opposite, mainly manifested as down-regulating in Group B/Group A （GB/GA） and up-regulating in Group C/Group B （GC/GB）. The analysis showed that these differential genes were mainly assigned to cell apoptosis, signal transduction, metabolism, cell proliferation and differentiation, cell cycle, blood coagulation, antioxidant activity, etc. Conclusions： sFHN was regulated by various genes; the regulation of YGY on expressions of these genes and the intra]extra-cellular signaling processes was possibly the molecular mechanism of YGY for preventing/treating sFHN. This study gave an explanation to the effectiveness of Chinese medicine in preventing/treating FHN from aspects of gene expression and enriched the Chinese medicine theory of ＂Kidney （Shen） governing bones＂.

右归饮、四君子汤、桃红四物汤调节肾虚、脾虚、血瘀证患者免疫功能的观察

目的:探讨右归饮、四君子汤、桃红四物汤对肾虚、脾虚、血瘀证患者免疫调节的不同作用。方法:用右归饮、四君子汤、桃红四物汤分别治疗肾虚、脾虚、血瘀证患者各40例,另分别设各证型20例予安慰剂作对照,观察治疗前后免疫功能情况。结果:四君子汤使脾虚患者、右归饮使肾虚患者的循环免疫复合物(CIC)水平下降(P<001),淋巴细胞转化率(淋转率)和自然杀伤(NK)细胞活性提高(P<001),四君子汤还使脾虚患者的IL2水平和嗜中性细胞吞噬指数提高(P<005);桃红四物汤使血瘀证患者CIC水平降低(P<001)的同时,提高了NK细胞活性(P<005)。结论:四君子汤、右归饮可明显提高脾虚证、肾虚证患者的免疫功能,特别是细胞免疫功能,尤以四君汤作用更全面显著。桃红四物汤消除免疫复合物的作用较为明显。

补肾和健脾对免疫系统不同作用方式的研究

目的：探讨补肾药对免疫系统的作用方式。方法：用３类复方对皮质酮大鼠分别在７天与１４天实验里，进行对神经内分泌及免疫系统不同作用方式的研究。结果：无论７天或１４天，健脾组的免疫系统均得到保护，而神经内分泌系统却未有明显作用，说明健脾药是对免疫系统的直接作用；补肾组虽７天实验尚未见对各系统有何影响，至１４天实验才显示对神经内分泌免疫系统的全面作用。结论：补肾药是先作用于神经内分泌系统，而后才影响于免疫系统，亦即是作用于神经内分泌免疫网络的下行通路。

右归饮对体外培养破骨细胞分化与功能的影响

目的:探讨右归饮对体外培养破骨细胞的分化、凋亡及骨吸收活性的影响。方法:分离培养大鼠破骨细胞,分别以空白对照血清、地塞米松+对照血清、地塞米松+右归饮血清的培养液来培养破骨细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色对TRAP阳性多核破骨细胞计数;采用吖啶橙荧光染色法计数破骨细胞的凋亡率;用RT-PCR测定ATPase a3基因相对表达变化分析破骨细胞骨吸收活性。结果:与空白对照血清组和对照血清+地塞米松组相比,地塞米松+右归饮血清组TRAP染色阳性的破骨细胞数量显著减少(分别为P<0.01,P<0.05),破骨细胞的凋亡率明显增加(P<0.01),ATPase a3基因表达明显减少(P<0.01)。结论:右归饮可抑制破骨细胞的形成和分化及骨吸收活性,促进破骨细胞的凋亡,从而发挥其抗激素性股骨头坏死的作用。

右归饮含药血清促进人血管内皮细胞增殖及抗氧化损伤的作用研究

[目的]观察右归饮含药血清促进人血管内皮细胞增殖及对氧化损伤的保护作用,探讨右归饮防治激素性股骨头坏死的作用机理。[方法]取对数生长期的人血管内皮细胞,分为空白组、模型组、药物Ⅰ组、药物Ⅱ组。模型组和药物I组以600μM H2O2作用2h建立氧化损伤模型,空白组、药物II组照常培养,2h后药物I组和药物II组分别加入相同浓度右归饮含药血清,空白组和模型组则分别加入等量空白血清。各组干预24h后通过倒置相差数字成像显微镜观察细胞形态及密度、MTT比色法检测细胞OD值,并分别于24h、48h、72h通过Realtime-PCR测定空白组、模型组、药物Ⅰ组细胞中血管内皮细胞生长抑制因子(vascular endothelial growth inhibitor,VEGI)的表达水平。[结果]与空白组相比,药物Ⅱ组细胞密度显著增高,形态完整,且OD值高于空白组(P<0.001);与模型组相比,用右归饮含药血清干预后,药物Ⅰ组细胞密度增高,形态较为完整,OD值高于模型组(P<0.01);PCR结果显示药物Ⅰ组细胞的VEGI表达水平低于模型组(24h,48h,P<0.01)。[结论]右归饮含药血清能在一定程度上促进体外培养的人血管内皮细胞增殖,同时对细胞氧化损伤模型具有保护作用,其作用可能与下调VEGI基因表达有关。

五种中药对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性的作用

目的:观察单味中药黄芪、丹参、淫羊藿及复方右归饮药物血清和煎剂以及雪莲花药物血清及其醇提液对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性的作用。方法:雪莲花乙醇浸泡后定容,其他单味和复方中药水煎定容,高压灭菌。按10倍于任用剂量进行SD大鼠灌胃,心脏采血,制备血清。取大鼠股骨和肱骨,分离骨髓间充质干细胞,常规培养传代3次后,加入含药血清、煎剂及雪莲花醇提液。药物血清分为15%1、0%5、%和1%浓度,其煎剂及雪莲花醇提液浓度分为10-2、10-3、10-4、10-5,作用3天后用MTT法测定细胞活力。结果:雪莲花含药血清及其醇提液在4个浓度组均显示促进细胞增殖。结论:雪莲花具有促进大鼠骨髓间充质干细胞体外培养增殖活性的作用。

右归饮对大鼠激素性股骨头坏死局部脂联素表达的影响

目的:研究补肾助阳中药右归饮对大鼠激素性股骨头坏死模型脂联素的影响。方法:取Wistar大鼠30只,随机分为空白对照组、模型组、右归饮治疗组,采用内毒素和甲基强地松龙肌肉注射诱导造成激素性股骨头坏死模型后,右归饮治疗组给右归饮灌胃,空白对照组和模型组以等量生理盐水灌胃治疗,于6周后手术取股骨头,观察股骨头病理形态,计算空骨陷窝率,利用基因芯片技术检测股骨头基因表达,并利用RT-PCR技术检测脂联素基因adipoq的表达情况。结果:①HE染色显示右归饮治疗组较模型组骨膜变完整,同源软骨细胞数增加,骨小梁变整齐,软骨下血管变丰富。②模型组空骨陷窝率最高,右归饮治疗组次之,空白对照组最低。空白对照组、右归饮治疗组的空骨陷窝率与模型组相比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。③基因芯片表达结果显示,空白对照组与模型组相比较,脂联素基因adipoq无明显差异(Ratio值<2.0);右归饮治疗组与模型组相比较,脂联素基因adipoq明显上调(Ratio值>2.0)。结论:在大鼠激素性股骨头坏死模型模型中,糖皮质激素联合内毒素造模对股骨头局部的脂联素表达无明显影响;补肾助阳中药右归饮能明显刺激股骨头局部的脂联素的表达。

右归饮对类固醇激素性股骨头坏死大鼠成骨-破骨体外共育体系中破骨细胞分化的影响

目的探讨右归饮对激素性股骨头坏死(SINFH)大鼠成骨-破骨体外共育体系中破骨细胞(osteoclast,OC)生长分化的影响。方法雄性SD大鼠70只,体重(100±20)g,用随机数字表法取30只用醋酸泼尼松龙49 mg/kg·d肌内注射造模,1周后随机抽取2只造模大鼠进行组织病理观察确定造模成功。40只正常大鼠随机分为高、中、低右归饮给药组及蒸馏水组。从造模大鼠股骨、胫骨分离培养成骨细胞(osteoblast,OB)和OC诱导5 d,将OB以1×105/mL密度接种于成骨-破骨细胞共育体系中,分别以蒸馏水血清(对照组)、低(0.5 mL/100 g)、中(1.0 mL/100 g)、高(2.0 mL/100 g)浓度右归饮含药血清作用于OB-OC共育体系。用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)鉴定OC和阳性多核细胞计数,用RT-PCR方法测定RANKL mRNA表达水平变化。结果与蒸馏水组比较,高、中浓度右归饮组TRAP染色阳性破骨细胞数量均显著减少(P<0.01);RANKL基因表达水平明显降低(P<0.01),高浓度右归饮组与低、中浓度组比较RANKL基因表达水平显著降低(P<0.01、P<0.05)。结论一定浓度的右归饮对SINFH大鼠体外成骨-破骨共育体系破骨细胞形成、分化有抑制作用,以高浓度右归饮作用最强。

右归饮影响SAMP6鼠血清骨重建调控因子的实验研究

目的观察右归饮对SAMP6鼠成骨-破骨调控因子骨源性碱性磷酸酶(BALP)和白细胞介素-11(IL-11)血清含量的影响,探讨右归饮防治骨质疏松症的作用机制。方法选取SAMP6鼠36只,按随机方法分为SAMP6对照组和SAMP6药物组;另取11只同月龄SAMR1鼠,作为同源对照(SAMR1对照组)。SAMP6对照组和SAMR1对照组给予生理盐水灌胃,SAMP6药物组给予右归饮灌胃,每日1次。连续12周后,ELISA法检测血清BALP和IL-11的含量。结果 SAMP6药物组和SAMR1对照组血清BALP含量明显高于SAMP6对照组,差异有统计学意义(P<0.01);SAMP6药物组血清BALP含量低于SAMR1对照组(P<0.01)。SAMP6药物组和SAMR1对照组血清IL-11含量明显低于SAMP6对照组(P<0.01);SAMP6药物组和SAMR1对照组血清IL-11含量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论右归饮能增加SAMP6鼠血清BALP含量,降低IL-11含量,推测其可能促进成骨细胞活性、降低破骨细胞活性,从而达到防治骨质疏松的目的。

中药右归饮加减联合糖皮质激素对系统性红斑狼疮肾功能、中医症状总积分的影响

目的研究分析中药右归饮加减联合糖皮质激素对系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者肾功能、中医症状总积分的影响。方法选取2014年1月—2018年6月医院中西医结合科127例患者作为研究对象,按照随机数字法对患者进行分组,其中采用中药右归饮加减联合糖皮质激素治疗的67例患者作为观察组,采用标准激素治疗的60例患者作为对照组。比较两组患者治疗前以及治疗后2周、4周的形体评分,记录并比较两组患者治疗前以及治疗后4周的血液免疫学、肾功能以及中医症状总积分。结果治疗2周后以及治疗4周后两组形体评分明显高于治疗前(P<0.05);治疗4周后观察组形体评分明显高于对照组(P<0.05)。治疗后两组CRP明显低于治疗前,C3、C4以及CH50明显高于治疗前(P<0.05);治疗后观察组CRP明显低于对照组,C3、C4以及CH50明显高于对照组(P<0.05)。治疗4周后两组Scr、BUN以及24 h尿蛋白明显低于治疗前(P<0.05);治疗4周后观察组Scr、BUN以及24 h尿蛋白明显低于对照组(P<0.05)。治疗4周后两组皮肤斑疹、眩晕耳鸣、腰膝酸软以及肢体疼痛明显低于治疗前,治疗4周后观察组皮肤斑疹、眩晕耳鸣、腰膝酸软以及肢体疼痛明显低于对照组(P<0.05)。结论中药右归饮加减联合糖皮质激素治疗能够改善SLE患者肾功能以及中医症状总积分,提高治疗效果。

右归饮择时使用对肾阳虚大鼠生长激素昼夜节律的影响

目的 探讨右归饮择时用药在肾阳虚证治疗中的意义。 方法 采用放免法 ,以肾阳虚大鼠血清生长激素为指标 ,观察右归饮择时用药的疗效。结果 右归饮择时用药对肾阳虚大鼠症状的改善有一定作用 ,并以卯时用药效果较好。结论 右归饮治疗肾阳虚证应当提倡择时用药。

富血小板血浆联合右归饮对骨质疏松模型大鼠的实验研究

目的研究富血小板血浆(PRP)联合右归饮对大鼠骨质疏松性骨折的影响。方法 8月龄SPF级SD雌性大鼠148只,随机分为4组:空白模型组(K组)、右归饮组(Y组)、PRP组(P组)、联合组(L组)。K组不做处理,其中P组和L组于骨折造模术前眼眶采血,制备PRP,在骨折模型建立术中将PRP凝胶注入骨折端;Y组及L组给予右归饮灌胃。观察骨折端影像学以及病理组织学变化,比较四组骨折愈合情况。结果从Micro-CT的骨痂图可见Y组、P组及L组在骨折后同一时间点骨痂的骨量较K组高。定量分析得出,每个时间点都是L组BV及BV/TV最高。组织病理学观察可见各实验组较K组的骨痂生长有明显改善。免疫组织化学观察结果:Col2a1在L组和P组在骨折术后1周表现为中度阳性,术后2周为强阳性,术后4周与6周为弱阳性。Y组骨折术后1周、2周均表现为中度阳性,术后4周与6周为弱阳性,K组术后1周表现为中度阳性,2周和4周时表现为弱阳性,6周时表现为阴性。结论 L组治疗大鼠骨质疏松性骨折较单纯的P组和Y组治疗效果更佳,能显著提高大鼠骨质疏松性骨折愈合质量,明显缩短骨折愈合周期。

右归饮对递增负荷运动大鼠睾酮和物质代谢的影响

目的:探讨长期大运动量训练对血睾酮和物质代谢以及补肾中药复方右归饮对其影响。方法:30只雄性SD大鼠,随机平均分为3组,分别为对照组(C)、训练组(T)和服药组(M,补肾法),进行8周递增负荷游泳,采用放免法和分光光度法观察8周递增负荷游泳和补肾中药复方对睾酮及肌糖元、肝糖元、血红蛋白和尿素氮的影响。结果:与对照组相比,训练后肌糖元和肝糖元的含量增加(P>0.05;P<0.05),血红蛋白降低而尿素氮升高(P<0.01;P<0.05);训练组血睾酮较对照组显著降低(P<0.05),而补肾中药复方组(M组)能显著提高血睾酮水平(P<0.05),并可提高肌糖元和肝糖元的含量(P<0.05;P<0.05)。结果提示,长时间大运动量训练可引起下丘脑-垂体-性腺轴产生抑制,造成运动性低血睾酮,负反馈调节作用受到不同程度的抑制,导致机体运动能力下降,恢复过程延长;而采用补肾中药复方可改善运动性低血睾酮,减缓对HPG轴负反馈的抑制作用,可以改善HPG轴的功能,增加肌糖元和肝糖元的含量,有利于大运动量训练后机体的恢复。

右归饮新方活性部位及其配伍的筛选

目的:明确右归饮新方中的各味药材的主要活性部位及最佳配伍。方法:以大鼠成骨细胞样细胞为模型细胞,考察各味药材不同提取部位及其配伍对成骨细胞增殖及分化的影响。结果:续断、淫羊藿及蛇床子的正丁醇部位的配伍具有最为显著的成骨细胞增殖活性。结论:右归饮新方活性部位及其配伍的筛选为后续创新中药的开发奠定基础。

右归饮对痛风性肾病大鼠活性氧/核因子-κB信号通路的调节及肾脏保护作用研究

目的:研究右归饮对痛风性肾病大鼠活性氧(ROS)/核因子-κB(NF-κB)信号通路的调节及肾脏保护作用。方法:90只大鼠随机分为6组,分别为对照组、模型组、右归饮低、中、高剂量组及别嘌呤醇组,除对照组外,其余大鼠采用干酵母饲料喂养联合腺嘌呤灌胃的方法建立痛风性肾病大鼠模型,右归饮低、中、高剂量组灌胃给予大鼠不同剂量的右归饮,别嘌呤醇组灌胃给予大鼠别嘌呤醇,对照组及模型组给予大鼠等量生理盐水,1次/d,连续给药28 d,测定大鼠24 h尿量及尿蛋白量、血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)及尿酸(UA)水平、肾组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及ROS水平,苏木精-伊红染色法检查大鼠肾组织病理学变化,Western blot检测大鼠肾组织烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX4)、p-NF-κB/P65及NF-κB/P65水平。结果:与模型组相比,右归饮各剂量组及别嘌呤醇组大鼠24 h尿蛋白量、血清TNF-α、IL-6、IL-1β、BUN、Scr及UA水平、肾组织MDA及ROS水平、肾组织NOX4、p-NF-κB/P65及NF-κB/P65水平均显著降低(P<0.05),大鼠24 h尿量及肾组织SOD活性显著升高(P<0.05),同时右归饮各剂量组及别嘌呤醇组大鼠肾组织病理学明显改善,且各项指标变化与右归饮剂量表现出依赖性。结论:右归饮能够通过降低痛风性肾病大鼠24 h尿蛋白量、血清TNF-α、IL-6、IL-1β、BUN、Scr及UA水平、肾组织MDA及ROS水平,升高大鼠24 h尿量及肾组织SOD活性而发挥其肾脏保护作用,其机制可能与抑制ROS/NF-κB信号通路有关。

右归饮对去势大鼠骨中BMP-2含量及相关因素影响的实验研究

目的:探讨右归饮对去势大鼠血清激素水平、骨密度及其生物力学的影响。方法:取12周龄W istar雌性大鼠32只,随机分为右归饮组、α-D3对照组、空白组、正常对照4组,每组8只。灌胃12周后,处死各组动物,以双能X线骨密度仪测定骨密度;通过三点弯曲试验记录载荷-变形曲线,测定骨生物力学指标。结果:右归饮治疗组血清中BGP、CT水平及骨密度明显高于模型组,去势大鼠的骨生物力学性能也得到改善。结论:右归饮能刺激骨形成,使疏松的骨组织恢复正常骨的生物力学性能,可能是通过调控体内激素水平(CT)、BMP-2的表达来实现的。

右归饮防治类风湿性关节炎大鼠膝关节骨吸收的研究

目的:观察右归饮抗类风湿性关节炎(RA)大鼠膝关节骨吸收的疗效。方法:SD大鼠60只随机分为空白对照组、模型组、右归饮组、甲氨蝶呤组。8 w后处死大鼠,获取膝关节标本,检测膝关节骨密度值,拍摄其钼靶片,并行病理检测。结果:与模型组比较,右归饮组、甲氨蝶呤组大鼠膝关节骨密度升高,差异有统计学意义(P<0.05);钼靶片示以上二组骨小梁较致密;镜检示右归饮、甲氨蝶呤均能抑制膝关节软骨破坏及炎症细胞浸润。上述作用右归饮优于甲氨蝶呤。结论:右归饮通过抑制RA大鼠膝关节软骨破坏,抑制炎细胞浸润而发挥抗RA大鼠膝关节骨吸收的作用。

右归饮对去卵巢血管钙化大鼠谷氨酸NMDA受体mRNA表达的影响

目的:观察右归饮对去卵巢血管钙化谷氨酸NMDA受体mRNA表达的影响。方法:40只SD雌性大鼠随机分为假手术组,模型组,低剂量组,高剂量组以及辛伐他汀组,采用华法令加注射维生素D3制备血管钙化模型,并于造模后中药低剂量组、高剂量组分别给予右归饮浓缩液5.35 g/(kg·d)、16.05 g/(kg·d)灌胃,辛伐他汀组给予辛伐他汀混悬水溶液5.25 mg/(kg·d)灌胃。假手术组和模型组给予等量生理盐水,共12周。于实验结束时采集血浆标本测定雌二醇和血脂的情况并应用FQPCR法检测谷氨酸离子受体mRNA表达。结果:模型组大鼠雌二醇、甘油三酯含量及NR1、NR2a、NR2b mRNA相对表达量明显降低,低密度脂蛋白含量明显升高,与假手术组比较,有统计学意义(P<0.05);中药高剂量组和低剂量组可提高雌二醇、甘油三酯以及NR1、NR2a、NR2b mRNA的表达,与模型组比较,有统计学意义(P<0.01),低剂量组、高剂量组和辛伐他汀组的LDL含量下降,与模型组比较,有显著性差异(P<0.05)。结论:右归饮可抑制去卵巢血管钙化的形成,可能与提高雌二醇水平以及上调NR1以及NR2a、NR2b mRNA表达有关。

右归饮对去卵巢血管钙化大鼠NMDAR1蛋白表达的影响

目的:观察右归饮对去卵巢血管钙化中谷氨酸受体变化的影响。方法:将40只远交群雌性大鼠(sprague dawley,SD)随机分为假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组和辛伐他汀组,采用皮下注射华法令加维生素D3制备血管钙化模型,造模后,低剂量组、高剂量组分别给予右归饮浓缩液5.35 g/(kg·d)和16.05 g/(kg·d)灌胃,辛伐他汀组给予辛伐他汀混悬水溶液5.25 mg/(kg·d)灌胃,假手术组和模型组给予等量生理盐水,共12周;实验结束时采集血浆标本测定雌二醇及血脂四项,采用苏木精-伊红染色法(HE染色)观察动脉钙化的情况,并采用免疫印迹试验检测N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR,NR)1蛋白的表达。结果 :模型组大鼠雌二醇、甘油三酯含量和NR1蛋白表达降低,P<0.05,低密度脂蛋白升高,P<0.05;高剂量组和低剂量组雌二醇、甘油三酯含量升高,NR1蛋白表达增加,P<0.05;高剂量组、低剂量组和辛伐他汀组低密度脂蛋白的含量降低,P<0.05;辛伐他汀组雌二醇无变化,P>0.05。结论:右归饮可抑制大鼠去卵巢血管钙化的形成,可能与提高雌激素水平和NR1蛋白的表达有关。

右归饮促进骨折愈合的最佳浓度的实验研究

目的:观察右归饮不同浓度促进骨折愈合的效果,获得右归饮治疗骨折的最佳浓度,并获得右归饮治疗的最佳时间。方法:将120只SD雄性大鼠,体质量(250±20)g,随机分为4组:骨折组、低浓度右归饮+骨折组、中浓度右归饮+骨折组、高浓度右归饮+骨折组,每组6只。造模完成后,骨折组用生理盐水灌胃,右归饮组灌服不同浓度右归饮汤剂,于造模后3、7、14、21、28 d处死大鼠取骨痂进行影像形态学及QPCR检测。结果:在各个时间点高、中、低浓度右归饮组均较对照组骨痂量明显增多,VEGF表达量显著升高(P<0.01),表达高峰出现时间明显提前、维持时间延长,且与浓度呈一定的正相关。结论:右归饮能明显促进骨折愈合,高浓度为治疗骨折的最佳浓度,并且应在早期即开始使用。