The detailed anti-tumor mechanisms of daphnanetype diterpenoids from Genkwa flos

Genkwa flos is a well-known traditional Chinese medicine, which exhibits abundant biological activities such as antiinflammatory, analgesic, immunoregulatory activities and anti-rheumatic arthritis activity. Recent pharmacological studies showed that Genkwa flos might also have the antitumor effect. Daphnane-type diterpenoids (DDs) are one of the main anti-tumor constitutions in Genkwa flos. However, the underlying anticancer molecular mechanisms of this type of compounds are still unclear. This review aims to give a systematic summary of DDs from Genkwa flos to better understand the anti-tumor activitiy by focusing on cell arrest, apoptosis, topoisomerase inhibition, melanin inhibition and the reverse of multi-drug-resistance (MDR). In addition, we are also going to make an overview of the mechanisms identified up to now. The significant findings may provide that DDs in Genkwa flos is a promising targeted-cancer agent.

基于网络药理学和分子对接探讨中药芫花治疗原发性痛经的作用机制

通过网络药理学和分子对接技术预测芫花治疗原发性痛经的功效物质基础及其潜在的作用机制。基于TCMSP数据库预测获得芫花的活性成分和作用靶点,同时借助DisGeNET等数据库获得与原发性痛经相关的靶点,基于获得的芫花与原发性痛经的交集靶点,使用STRING数据库构建交集靶点蛋白互作网络,并采用Cytoscape3.7.2构建芫花–活性成分–靶点–原发性痛经网络。采用DAVID数据库进行基因本体论(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,利用Autodock tools将核心靶点与对应的活性成分进行分子对接。结果表明,中药芫花治疗原发性痛经的核心活性成分为芫花素、柚皮素、7-羟基-6-甲氧基-3,7’-双香豆素、龙胆山酮酚、羟基芫花素、山奈酚、木犀草素、谷甾醇、羟光刺苞菊内酯;关键靶点包括ESR1、PTGS1、PTGS2、GSTM1、CYP1A1、OPRM1、NTRK2和NR1H2;涉及的生物学过程主要与老化、一氧化氮生物合成过程的正向调节、细胞质和ATP酶结合等有关;KEGG通路主要富集在癌症的发病途径、化学致癌作用–受体激活、化学致癌作用-DNA加合物等。此外,分子对接显示核心活性成分芫花素与关键靶点蛋白之间的对接能量值均小于–7.0kcal·mol–1,具有强烈的结合活性,能形成稳定的结构构象。运用网络药理学和分子对接方法从“中药–成分–靶点–疾病”的思路初步探究芫花治疗原发性痛经的活性物质基础,为深入研究该类成分治疗痛经的作用机制奠定基础。

醋芫花标准汤剂HPLC特征图谱研究

目的:建立醋芫花标准汤剂高效液相色谱法(HPLC)特征图谱,在全面表征其成分特征的同时,能够区别于芫花标准汤剂。方法:采用Kromasil Cl8色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇(A)-0.05%磷酸水溶液(B)为流动相梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为35℃,进样量为20µL,检测波长为238 nm。将得到的21批芫花标准汤剂和21批醋芫花标准汤剂特征图谱经“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004A版)进行峰匹配,分别明确共有峰个数,并生成对照特征图谱。通过对比,明确芫花标准汤剂与醋芫花标准汤剂特征图谱的区别点,指认共有特征峰,并对比指认的特征峰峰面积的变化情况。结果:通过对比生成的芫花标准汤剂和醋芫花标准汤剂对照特征图谱,发现其中tR在27.0 min的特征峰是关键区别点,推测该成分可能为醋芫花挥发油中新生成的烯类化合物。指认7个特征峰成分,分别为芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、芫花素-5-O-茜草苷、木犀草素、椴树苷、芹菜素、羟基芫花素和芫花素,其含量在炮制前后并没有明显的变化。结论:该方法简单可行,能够较好地区分芫花标准汤剂与醋芫花标准汤剂,从源头加强样品质量控制的同时,可为醋芫花标准汤剂及其配方颗粒质量控制提供参考。

芫花药材质量标准研究

目的:对17批芫花药材样品进行定性定量试验研究,提高芫花药材质量标准。方法:采用薄层色谱法鉴别芫花药材中芫花素成分;以高效液相色谱法测定其含量并制定限度要求,色谱柱为 Kromasil C_(18)(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.5),流速为0.8 mL·min^(-1),柱温为40℃,检测波长为338 nm。结果:芫花药材中芫花素的薄层色谱鉴别特征明显,专属性强;芫花药材中芫花素的含量测定线性范围为0.086～0.432 μg(r=0.9998),平均回收率(n=5)为100.4%(RSD=2.4%),测得芫花药材中芫花素含量不低于0.2%。结论:本方法简单准确地对芫化药材的有效成分芜花素进行定性定量测定,为提高芫花药材的质控方法提供了实验数据,对于保证其质量和临床疗效具有重要的意义。

GC法同时测定芫花中棕榈酸与亚油酸的含量

目的建立同时测定芫花药材中棕榈酸和亚油酸含量的气相色谱分析方法。方法采用毛细管气相色谱法,甲酯化后测定芫花中棕榈酸与亚油酸的含量。采用DB-17石英毛细管柱（30 m×0.25 mm,0.25μm）;氢火焰离子化检测器（FID）;程序升温：起始温度180℃,以5℃.min-1升至230℃;进样口温度：250℃;检测器温度：270℃;载气为氮气,流速：1.2 mL·min^-1;分流比为20∶1。结果棕榈酸甲酯和亚油酸甲酯的质量浓度分别在0.079-1.578 g.L-1（r=0.999 6）和0.029~0.590 g.L-1（r=0.999 7）内与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率（n=9）分别为98.1%（RSD=2.7%）和99.7%（RSD=2.8%）。结论本方法简便、快速、准确,为芫花的质量控制方法提供依据。

HPLC法分析炮制对芫花中芫花素的影响

用HPLC法分析了芫花各种炮制品中芫花素的含量变化。结果表明:芫花经不同方法炮制后芫花素的含量均有所降低,以醋炙降低最少。并对各大区芫花饮片的芫花素含量进行了定量分析,为制订芫花饮片的质量标准提供了实验依据。

中药芫花总黄酮含量测定方法研究

目的建立芫花总黄酮的含量测定方法。方法采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法、AlCl3显色法、盐酸-镁粉显色法等3种不同的显色方法测定芫花总黄酮含量。结果采用盐酸-镁粉显色法,以芹菜素为对照品,线性范围为33.6～201.6μg(r=0.999 8),平均回收率为98.57%,相对标准偏差为0.78%(n=9)。结论 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法和AlCl3法不能用于芫花总黄酮的测定;盐酸-镁粉显色法准确度、精密度高、重复性好,是芫花总黄酮定量分析的合理方法。

甘草与大戟、甘遂、芫花的反药组合对大鼠离体回肠运动的影响

目的从离体回肠运动的角度,探讨中药"十八反"中甘草与大戟、甘遂、芫花存在配伍禁忌的科学依据。方法制作大鼠离体回肠模型,以回肠收缩张力为指标,观察不同浓度的甘草与大戟、甘遂、芫花的单煎液、合并液、合煎液对大鼠离体回肠运动的影响。结果甘草单煎液呈现抑制回肠收缩作用,而大戟、甘遂、芫花各单煎液则表现为不同程度促进回肠收缩作用;甘草分别与大戟、甘遂、芫花合并给药后,可减弱后者促进回肠收缩的作用;各合煎液促进回肠收缩的作用均弱于其单煎液,其中甘草-甘遂合煎液的作用弱于其合并液,而甘草-大戟合煎液与甘草-芫花合煎液强于其合并液。结论甘草与大戟、甘遂、芫花合用后能显著抑制后者促进回肠收缩作用,从该角度探讨和揭示了甘草与具有峻下逐水功效的各药物存在配伍禁忌的作用特点与机制。

芫花对豚鼠膀胱逼尿肌收缩活动的影响

芫花可剂量依赖性增高豚鼠膀胱逼尿肌肌条的张力，增大膀胱逼尿肌肌条的收缩波平均振幅。

“十八反”中药甘草芫花不同配伍方式的HPLC对比分析

目的:从化学成分变化的角度初步阐释了甘草-芫花作为配伍禁忌的合理性。方法:对不同配伍方式的甘草-芫花提取液进行HPLC对比分析。结果:不同配伍方式的HPLC图存在一定差异,31～47min之间混煎液出现1个特征峰,而合并液在此时间段内有10个特征峰,初步推测芫花甘草两种不同的配伍方式,其煎出成分有所差异。结论:芫花-甘草不同的配伍方式,其化学成分具有差异,这种差异同甘草与芫花作为配伍禁忌之间存在的关系有待进一步探讨。

HPLC法测定芫花中芫花素的含量

采用Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ５ＲＰ－１８柱，甲醇－水－冰乙酸（６５：３５：５）为流动相，３３２ｎｍ检测，建立了ＨＰＬＣ测定芫花中芫花素含量的方法，加样回收率为９５．４６％，ＲＳＤ为１．１５％，测得芫花中芫花素的含量为０．１５５５％。

基于甘草对醋芫花泻下逐水效应的影响探讨反药组合配伍禁忌机制

目的探讨醋芫花与甘草配伍禁忌的可能机制，以理解泻下逐水的原理。方法采用醋芫花粉末和甘草水提液，醋芫花剂量为0．12，0．18和0．24g·kg^-1，甘草剂量为0．2，0．4和0．8gg·kg^-1。，采用2因素4水平析因设计方案给小鼠分组并一次性ig给药，记录小鼠ig给药后0—4h内每小时每只小鼠的排尿量，同时记录每只小鼠首次排便时间和0～4h内排便次数及其粪便形状。采用单因素方差分析和重复测量方差分析对不同时间段小鼠排尿量和排便次数分别进行统计学分析。结果与正常对照组比较，醋芫花0．12和0．18g·kg^-1单用具有明显的利尿泻下作用，以利尿作用较为显著，药后1～2h时段排尿量增加，比正常对照组增加45％（P〈0．01）；甘草3个剂量单用未表现出促进或抑制利尿的作用。醋芫花0．12g·kg^-1与甘草配伍合用，与等剂量醋芫花0．12g·kg^-1单用组比较，药后1—2h内小鼠排尿量明显减少（P〈0．01），提示甘草可抑制醋芫花的利尿作用。与正常对照组比较，醋芫花0．18g·kg^-1单用可显著增加小鼠的干便重量和排便次数（P〈0．01），与甘草配伍合用对小鼠排便量和排便次数无明显影响。结论在《中华人民共和国药典》等效剂量范围内，醋芫花与甘草反药组合可明显拮抗醋芫花的利尿作用，提示甘草“甘缓守中”的药性可减缓芜花“利水”的作用，这可能是芫花与甘草配伍禁忌的原因之一。

海藻、大戟、甘遂和芫花分别与不同剂量的甘草配伍对小鼠肠功能的影响

目的探讨海藻、大戟、甘遂和芫花分别与不同剂量的甘草配伍对肠功能的影响。方法采用均匀设计进行分组。小鼠分别ig给予海藻甘草、大戟甘草、甘遂甘草或芫花甘草合煎液1次,分别于给药后20,60,30和20min后,再ig给予5%印度墨汁混悬液0.2ml。给予墨汁20min后处死小鼠,测定小肠推进率(IPR)。结果大戟甘草合煎液组小鼠在总给药剂量0～30g·kg-1范围内且总给药剂量一定时,随甘草剂量的增加小鼠IRP降低(R=0.7853,P<0.05)。芫花甘草合煎液组总给药剂量低于5g·kg-1时,小鼠IRP未见明显变化;总给药剂量>5g·kg-1且一定时,小鼠IRP随甘草呈剂量依赖性增加(R=0.8414,P<0.05)。海藻甘草合煎液和甘遂甘草合煎液组海藻和甘遂与甘草配伍比例的变化对IRP无明显影响。结论在一定的总给药剂量范围内,大戟甘草合煎液对小鼠肠功能的影响与配伍比例密切相关,甘草剂量增加时小鼠肠功能减弱。芫花甘草合煎液对小鼠肠功能的影响也与配伍比例密切联系,甘草剂量增加时肠功能增强。

芫花炮制的研究概况

目的对芫花炮制方法、炮制前后的化学成分及其药理作用的研究进展作一综述,提供有关芫花研究的相对较为全面的借鉴资料。方法查阅近30年来国内外公开发表的有关芫花及其炮制的相关文献,对芫花炮制方法、炮制前后有效成分变化、炮制后药理作用及临床应用的研究进展进行论述。结果研究芫花炮制前后的化学成分变化以及药理作用具有重要的意义。结论为芫花炮制的进一步研究提供了依据。

炮制对芫花中芫花素含量的影响

采用薄层扫描法对芫花不同工艺炮制品和全国各大区芫花样品中的芫花素以及将芫花素单体经不同模拟炮制工艺处理的样品进行了含量测定。

芫花挥发油成分GC指纹图谱研究

目的建立芫花挥发性成分的GC指纹图谱,为芫花药材的鉴别及品质控制提供依据。方法采用GC色谱法对所采集的不同地区的芫花药材进行指纹图谱研究,建立GC指纹图谱共有模式,并进行聚类分析和相似度比较。结果 GC指纹图谱对芫花中主要成分均得到较好分离,根据聚类分析和相似度分析处理结果,不同地区的芫花药材指纹图谱相似度存在一定差别。结论该法为芫花药材的质量评价提供科学依据。

薄层扫描法测定芫花中芫花素含量

采用薄层扫描法对芫花不同工艺炮制品中的芫花素进行了含量测定，结果表明芫花不同工艺的炮制品中其含量为０．１２８％～０．３８９％，回收率为９８．８％，为芫花的最佳炮制工艺筛选提供了部分参考依据。

响应面法优化芫花总黄酮的提取工艺

以乙醇为溶剂,采用回流提取的方法,建立芫花中总黄酮类物质的最佳提取工艺。在单因素实验的基础上,运用四因素三水平的Box-Behnken中心组合试验设计原理进行实验设计,建立提取温度、提取时间、乙醇浓度、料液比与芫花总黄酮得率之间的数学模型。该模型的响应面分析结果表明,所建立的回归方程极显著,拟合性好。在总的作用因素中,平方项对总黄酮的得率的影响最为显著,其次为一次项,交互项的影响相对较小。在回流提取条件下,乙醇浓度对总黄酮得率的影响最大,其次是料液比,提取时间和提取温度影响较小。最终得出芫花总黄酮的最佳提取工艺为:提取温度73℃、提取时间1h、乙醇浓度78%、料液比料液比1∶12(g/mL),在此条件下,芫花总黄酮得率为2.239%。

基于析因设计评价芫花-甘草反药组合对小鼠自发活动的影响

目的研究芫花与甘草配伍对小鼠自发活动的影响。方法分别对芫花-甘草配比为1∶3.3的低、高2个剂量组,按芫花和甘草两因素,采用2×2析因设计进行实验。于给药前及给药后1、3h测定小鼠自发活动数,计算自发活动抑制率。结果给药后3h,芫花-甘草反药组合低剂量组小鼠自发活动抑制率仅与相应的甘草组比较有统计学差异(P<0.05),且反药组合对自发活动抑制率的影响无交互作用;芫花-甘草反药组合高剂量组小鼠自发活动抑制率与对照组及相应的单药组比较均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),且反药组合对增加小鼠自发活动抑制率有交互作用。结论芫花-甘草配比在1∶3.3时,一定剂量范围内,芫花与甘草反药组合对增加小鼠自发活动抑制率存在交互作用。

芫花水提物对斑马鱼肝脏毒性机制研究

目的探讨芫花水提物对斑马鱼幼鱼的肝脏毒性及其机制。方法用高、中、低浓度,分别是200 mg/L、150 mg/L、100 mg/L的芫花水提物处理受精4天的斑马鱼幼鱼,每组斑马鱼尾数为20,24小时后收集幼鱼样本,实验重复3次,通过对给药处理的幼鱼样本进行苏木精—伊红染色法制作病理切片观察病理状态;油红O染色观察脂肪堆积情况;对幼鱼组织样本中的RNA进行提取,用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q-RT-PCR)测定与肝脏相关基因的表达水平的变化;测定Caspase-3活性观察细胞凋亡,评价芫花水提物给药处理的斑马鱼幼鱼肝脏毒性表现形式及对其机制进行探讨。结果肝脏病理切片结果显示,与空白对照组相比,给药组中斑马鱼幼鱼肝脏细胞结构改变,出现空泡化,肝实质细胞减少,出现萎缩变形;油红O染色结果中给药组斑马鱼肝脏处有色素沉着,表明有脂肪堆积;通过q-RT-PCR测定肝脏相关基因的表达水平,结果显示,相对于空白对照组,给药组的激活转录因子4(activating transcription factor 4,atf4a)、90KDA热休克蛋白Β1(recombinant human heat shock protein 90kDa beta(GRP94)member1,hsp90b1)、EIF2S1蛋白磷酸化抗体对(protein phosphorylation antibody pair,eif2s1)、脂肪酸合成酶基因(fatty acid synthase,fasn)、视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4,rbp4)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、BH3结构域凋亡诱导蛋白(Bid)的mRNA表达水平显著上调(P<0.01);丙酮酸脱氢酶E1α亚单位基因(pyruvate de-hydrogenase complex E1ɑsubunit,pdha1a)、肝红细胞丙酮酸激酶(recombinant human pyruvatekinase,liver and RBC,pklr)、解偶联蛋白2(uncouplingprotein 2,ucp2)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase 1,sod1)、自噬基因(beclin)、自噬相关蛋白3(autophagy related 3 homolog,ATG3)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达下调(P<0.01);Caspase-3测定结果显示其活性增强(P<0.05)。结论芫花水提物诱导斑马鱼幼鱼的肝脏细胞结构改变,出现空泡化、萎缩变形等病理状态;并在肝脏处有脂肪堆积现象,其原因可能与肝脏代谢功能异常有关;结合基因测定结果,推测芫花的毒性机制可能与线粒体功能失常,脂质代谢障碍相关,进而诱导内质网应激,氧化应激及炎症反应最终导致细胞凋亡。