噬菌体Z基因组生物合成通路的研究进展

噬菌体基因组中存在丰富的碱基修饰,主要用于逃避宿主内切酶的切割。40多年前,在蓝藻噬菌体S-2L的DNA中,研究者发现2-氨基腺嘌呤(Z)完全取代腺嘌呤(A),与胸腺嘧啶(T)形成具有三根氢键的互补配对,形成了特殊的Z基因组。近年来,研究者在多个噬菌体中发现并证实了噬菌体Z基因组生物合成通路。该通路是一个多酶系统,其中包含由噬菌体DNA编码的2-氨基脱氧腺苷琥珀酸合成酶(PurZ)、脱氧腺苷三磷酸水解酶(dATPase/DatZ)、脱氧腺苷/脱氧鸟苷三磷酸的焦磷酸水解酶(DUF550/MazZ)和DNA聚合酶(DpoZ)。本文在简述噬菌体中各种修饰核苷发现历史的基础上,详细介绍了Z基因组生物合成通路中多种酶的研究进展,最后对Z基因组及其合成通路中多种酶的应用进行了展望,以期为该领域的研究提供借鉴和参考。

含GFP-Lac Z基因的伪狂犬病病毒上海株缺失株的构建

在伪狂犬病病毒 (PRV)上海株gI和gE基因克隆鉴定的基础上 ,用BamHⅠ +BstpⅠ去掉gE基因的 5′端 36 3bp ,在缺失位置插入绿色荧光蛋白 (GFP)和LacZ基因 ,构建含双报告基因的PRV SH转移载体pgEI GFPZ。将pgEI GFPZ转染PRV SH的BHK 2 1细胞 ,待出现 80 %病变后收获病毒 。

筛选化学诱变原的RNR3调控重组LacZ基因酵母细胞的建立

目的:建立可筛选化学诱变物的RNR3调控重组Lac Z基因酵母细胞。方法:利用降式PCR技术从酵母基因组中扩增RNR3启动子,将其插入到pMP206/ERE酵母报告载体,构建成RNR3调控的Lac Z酵母报告载体,将该载体转入W303-1A酵母细胞,构建成RNR3调控的重组Lac Z基因酵母细胞。用数种化学诱变原作用于该重组基因酵母细胞,观察其对RNR3的诱导表达。结果:放线菌素D、丝裂霉素C、阿非迪霉素和溴乙锭不能诱导RNR3的表达,而甲磺酸甲脂、瘤可宁、顺铂、4-硝基-N-氧化喹啉、博来霉素、福莱霉素、5-氟尿嘧啶、喜树碱和羟基脲诱变原与RNR3表达有明显的剂量效应关系。结论:该重组酵母可用于对多种化学诱变原的快速筛选。

组织蛋白酶Z基因启动子部分位点在成人哮喘中的差异性甲基化表达及意义

目的探讨组织蛋白酶Z基因(CTSZ)启动子区位点(cg01623438,cg02744249)在哮喘患者中的差异性甲基化表达及其与哮喘控制状态和肺功能的相关性,并探讨在成人哮喘诊断中的应用价值。方法选取于我院就诊的哮喘患者30例为哮喘组,根据哮喘控制评分将其分为三组,同时选取性别年龄匹配的同期健康体检成人30例为对照组。采集鼻黏膜上皮细胞,检测两位点甲基化水平并进行肺功能相关性分析,绘制ROC曲线分析其诊断应用价值。结果哮喘组两位点甲基化水平均低于正常对照组,且哮喘未控制组中甲基化水平最低,部分控制组次之,控制组最高。甲基化水平与肺功能改变呈负相关。单位点cg01623438的ROC曲线分析示,曲线下面积(AUC)为0.806(95%CI:0.683~0.896),敏感性为100%,特异性为50%(P <0.000 1);单位点cg02744249分析示AUC为0.749(95%CI:0.620~0.852),敏感性为43.3%,特异性为100%(P=0.000 1);两位点联合分析示AUC为0.827(95%CI:0.707~0.912),敏感性为66.7%,特异性为83.3%(P <0.000 1)。结论哮喘患者CTSZ启动子区出现明显低甲基化修饰,且与哮喘控制情况及肺功能存在一定相关性,提示可能对成人哮喘患者的诊断具有一定价值。

猪A3Z2基因生物信息学分析及其对PEDV复制的抑制作用

【目的】对猪源载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽蛋白3(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide protein 3,APOBEC3,简称A3)家族的A3Z2基因进行克隆、生物信息学分析,筛选稳定表达A3Z2的IPEC-J2细胞,研究A3Z2对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)增殖的影响,以期为研究A3Z2的抗病毒功能奠定基础。【方法】以IPEC-J2细胞总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增猪A3Z2基因CDS区,并对其进行遗传进化和生物信息学分析。构建pcDNA3.1-3×Flag-A3Z2载体,将其转染IPEC-J2细胞后经G418筛选、有限稀释法和单克隆细胞培养,获得稳定表达A3Z2的细胞株。分别采用间接免疫荧光试验和Western blotting方法鉴定A3Z2的表达,采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分析PEDV N基因的mRNA和蛋白表达水平。【结果】猪A3Z2基因CDS区长843 bp,编码280个氨基酸,分子质量约为32.7 ku,不存在跨膜区及信号肽切割位点,主要存在于细胞核中。A3Z2蛋白二级结构由α-螺旋(27.14%)、延伸链(17.86%)、β-转角(6.43%)和无规则卷曲(48.75%)构成。通过细胞筛选获得稳定表达A3Z2的细胞株IPEC-J2-A3Z2;间接免疫荧光方法和Western blotting结果显示,A3Z2能在IPEC-J2细胞中表达。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,细胞株IPEC-J2-A3Z2中PEDV N基因的mRNA和蛋白表达均被A3Z2抑制。【结论】本研究成功克隆了猪A3Z2基因,筛选获得了IPEC-J2-A3Z2细胞株,证实了A3Z2抑制PEDV复制的作用,为研究PEDV与A3Z2相互作用的分子机制和以此为靶点筛选抗PEDV新药提供了思路。

大肠杆菌O157 Z4182基因的克隆与表达

根据大肠杆菌 O15 7Z4182基因设计 1对引物 ,并在其 5′端分别加入 Nco 、Xho 酶切位点 ,用聚合酶链反应(PCR)从本试验用的大肠杆菌 O15 7及 1株产志贺毒素大肠杆菌 (STEC) O8、1株肠道聚集粘附大肠杆菌 (EAgg EC)和 1株产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC)菌株中也扩增出了 80 3bp的 DNA片段。以大肠杆菌 O15 7菌株 94H的 DNA为模板 ,用上述引物做 PCR,将其产物连接到载体质粒 p ET2 8a(+) ,然后转化到宿主菌大肠杆菌 L E392 ,从该菌中提取重组质粒 ,再将其转化到表达宿主大肠杆菌 BL2 1(DE3) ,用 PCR、限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定 ,表明 Z4182基因定向克隆到了载体质粒 p ET2 8a(+)。将转化子培养并经 IPTG诱导后 ,做SDS- PAGE电泳 ,表明该菌株可以表达 Z4182基因。本试验为阐明大肠杆菌 O15 7Z4182基因的分布及探讨该基因产物的功能和致病作用奠定了基础。

快速检测四环素类抗生素的重组Lac Z基因酵母细胞的建立

以载体双表达的方式构建监测环境中四环素类抗生素污染的重组酵母细胞。在表达载体中,用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)启动子驱动四环素阻遏蛋白基因(TR)的表达,并使其与V5抗原表位编码基因相融合。在报告载体中,用四环素效应元件(TRE)调控的Lac Z作为报告基因。将两者转化于酵母细胞中,构建成四环素类抗生素调控的重组Lac Z基因酵母细胞。用不同浓度的四环素类抗生素和非四环素类抗生素对重组酵母细胞分别进行敏感度和特异度研究。结果表明四环素类抗生素与该重组酵母细胞报告基因表达水平有明显的剂量效应关系,说明对检测四环素类抗生素有较好的敏感性,而非四环素类药物与重组酵母细胞报告基因表达水平之间无明显的剂量效应关系,说明其检测具有良好的特异性。该重组基因酵母细胞可用于对环境四环素类抗生素污染程度的监测。

水稻P450基因Oscyp71Z2增强稻瘟病抗性的机制

【目的】分析水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2在稻瘟病抗性中的作用,并解析其介导的水稻抗稻瘟病机制。【方法】根据高抗稻瘟病转hrf1水稻NJH12表达谱结果,筛选到一个表达量高达114.6倍的细胞色素P450基因Oscyp71Z2(NCBI登录号:Os07g0217600)。根据Oscyp71Z2全长编码区序列设计引物,以水稻模式粳稻品种日本晴的cDNA为模板,通过PCR扩增Oscyp71Z2全长编码区序列。将所得的cDNA序列经测序后,与双元表达载体pVec8连接,构建超量表达载体pVec8::Oscyp71Z2。采用冻融法将构建的超量表达载体pVec8::Oscyp71Z2质粒转入农杆菌菌株EHA105,并利用农杆菌转化法获得Oscyp71Z2超表达水稻。常规PCR技术检测T4代Oscyp71Z2超量表达水稻中选择标记基因潮霉素磷酸转移酶编码基因(hygromycin phosphotransferase gene,hph),并通过qRT-PCR检测超量表达水稻中目的基因Oscyp71Z2的表达量。进一步对阳性超量表达水稻(T4、T5和T6)进行稻瘟病表型鉴定,并检测植保素含量变化(T4)。【结果】RT-PCR和qRT-PCR结果显示,水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2在高抗稻瘟病的转hrf1水稻中有较高的表达,与表达谱数据一致。通过生物信息学分析Oscyp71Z2全长1 554 bp,含有2个细胞色素P450保守结构域,是CYP71Z2亚家族成员。将Oscyp71Z2成功连接到双元载体pVec8,利用农杆菌介导法获得Oscyp71Z2超量表达水稻。超量表达水稻株系在各生育期、株高等性状,与非转基因水稻日本晴基本一致。超量表达株系中Oscyp71Z2的表达量较野生型有显著升高。超量表达水稻的穗颈瘟抗性等级维持在1—2级,表现为抗病或者中抗,而野生型水稻的穗颈瘟等级为3—4级,表现为感病,Oscyp71Z2在水稻中超量表达显著增强了对穗颈瘟的抗性。Oscyp71Z2超量表达株系每克新鲜叶片中植保素MA和PB含量平均是328和124 ng,相对于野生型的85和42 ng·g-1新鲜叶片有显著升高。Oscyp71Z2超量表达株系中涉及到植保素MA和PB合成通路的4个关键基因的表达量较野生型有显著地升高。【结论】水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2通过调控植保素生物合成通路,赋予水稻稻瘟病抗性。

肠出血性大肠杆菌O157：H7 z1445基因缺失株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7的z1445基因,构建大肠杆菌z1445基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别经酶切后连接到p UC19-kan质粒的卡那霉素抗性基因kan两侧,PCR获得中间嵌合kan基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46敲除z1445基因,利用质粒p CP20去除抗性标记基因;PCR鉴定及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生株的生长曲线。结果:敲除了z1445基因,突变株与野生株的生长曲线接近。结论:构建了z1445基因缺陷型菌株,为进一步分析z1445基因在O157∶H7与宿主的相互作用中发挥的作用提供了材料。

无蹼壁虎6个鸟类Z染色体连锁基因的cDNA克隆和序列分析

利用RT-PCR技术从无蹼壁虎中获得了6个鸟类Z染色体连锁基因的cDNA片段序列。与铅山壁虎的同源基因序列相比，除CHD1-5＆#39;端序列中有3 bp的缺失外，其他基因序列均具有相同的核苷酸和氨基酸长度，且核苷酸序列和氨基酸序列的保守性均非常高（97%~100%）。在与有鳞目、龟鳖目和鳄目的其他已知序列比较时，发现6个基因的8个片段有不同程度的同源性，其中GHR基因的同源性最低，与该基因片段在进化分析中较高的ω值（ Ka/Ks）是一致的。性染色体连锁基因的克隆和染色体定位，将有助于进一步了解壁虎类甚至高等脊椎动物不同类型性染色体的起源和进化。

Polycomb家族基因BmSu(z)12在家蚕幼虫中的表达研究

[目的]研究家蚕Polycomb蛋白家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达情况.[方法]根据家蚕基因组预测的BmSu（z）12基因序列,设计特异引物,利用qRT-PCR对该基因在家蚕不同龄期幼虫中的表达进行研究.[结果]BmSu（z）12基因在5龄幼虫蜕皮后2d和变态前2d有较高表达,而在1～5龄取食中期表达量较低,表达特征具有一定的规律性.[结论]BmSu（z）12基因在家蚕幼虫生长发育中具有重要作用,该研究为进一步研究家蚕SU（Z）12蛋白的功能奠定基础.

老年高血压病人血浆蛋白Z水平变化及蛋白Z内含子FG79A基因多态性的临床意义

目的探讨老年高血压病人血浆蛋白Z水平变化及蛋白Z内含子FG79A基因多态性的临床意义。方法选取2018年1月—2019年1月我院收治的老年高血压病人220例作为观察组,其中高血压1级65例,高血压2级110例,高血压3级45例;同时选取健康体检者220名作为对照组。采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性检测蛋白Z内含子FG79A基因多态性及血浆蛋白Z水平。结果观察组和对照组血浆蛋白Z内含子FG79A基因型和等位基因比较,差异无统计学意义(P>0.05);观察组不同高血压分级病人蛋白Z内含子FG79A基因型分布比较,差异无统计学意义(P>0.05)。观察组血浆蛋白Z水平高于对照组(P<0.05);高血压分级越高病人血浆蛋白Z水平越高,其中高血压3级病人血浆蛋白Z水平高于高血压1级和2级病人(P<0.05);观察组蛋白Z内含子FG79A不同基因型病人血浆蛋白Z水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论蛋白Z内含子FG79A基因多态性与老年高血压发病无明显关系,但血浆蛋白Z水平在老年高血压疾病进展过程中可能有一定作用。

蛋白Z的临床应用研究现状

自1977年由Prowse和Esnouf首次从牛血浆中分离出蛋白Z（Protein Z,PZ）[1]之后,1984年由Brose等[2]报道了人类血浆Z.PZ是一种新的维生素K依赖性的糖蛋白,属于丝氨酸蛋白酶抑制性家族成员,由于其许多方面类似于依赖维生素K的其他凝血因子,长期以来并末受到人们的关注,最近研究资料1表明,PZ对多种疾病的诊断、治疗、预防具有一定的重要价值,尽管存在一些争议学说,但随着人们对PZ的深入研究,PZ在临床的广泛应用越来越受到关注;由此本文对PZ临床应用价值的研究现状作一综述.

EB病毒融合基因重组BCG穿梭质粒的构建及表达

分别以卡介苗(BCG)和EB病毒融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291bp的Z2A基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS。再将EB病毒融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG。SDS-PAGE分析结果表明,构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261,电转化导入BCG,能够在BCG中分泌表达。

lef-12基因缺失对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制和基因转录的影响

晚期表达因子12(late expression factor 12,LEF-12)是昆虫核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus,NPV)基因组编码的转录调控因子之一。为了研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)LEF-12的生物学功能,通过Red重组技术敲除BmNPV的lef-12基因,构建lef-12缺失型病毒lef12-ko-Bacmid,再利用Bac-to-Bac系统将lef-12重新补回到病毒基因组中,获得补回型病毒lef12-re-Bacmid。将野生型病毒wtBacmid、lef12-ko-Bacmid和lef12-re-Bacmid分别转染BmN细胞,发现3种病毒均可在转染的细胞中产生具有感染活性的病毒粒子,但病毒滴度测定结果显示lef12-ko-Bacmid的病毒粒子产量比wtBacmid下降了3倍左右,而lef12-re-Bacmid的病毒粒子产量基本上恢复到了野生型病毒的水平,表明lef-12的缺失会影响病毒在宿主细胞中的增殖。进一步研究lef-12敲除对病毒基因组复制和基因转录的影响,结果表明当lef-12缺失后,BmNPV DNA复制没有受到明显影响,说明lef-12不是病毒复制的必需基因;但lef-12缺失后,病毒晚期基因vp39、极晚期基因p10的转录水平均明显低于野生型和补回型病毒。透射电子显微镜观察结果也进一步证实lef-12缺失后,病毒仍能进行正常复制和装配,但与野生型病毒相比其增殖数量有所下降。上述研究结果提示:BmNPV lef-12不是病毒基因组复制的必需基因,但其缺失将导致宿主细胞的感病时间延迟,对病毒晚期和极晚期基因的转录也具有显著影响。

禾本科植物自交不亲和性及其分子生物学研究进展

禾本科植物自交不亲和性是禾本科植物中广泛存在的一种生殖隔离现象,有利于防止近交衰退、保持遗传变异。已报道自交不亲和禾本植物有着相同的自交不亲和系统,是一种特殊的配子体自交不亲和类型,和单一位点控制的自交不亲和性不同,其不亲和性由非连锁的两个复等位基因位点S和Z控制。自交不亲和反应中涉及了花粉蛋白质的磷酸化、Ca2+浓度的变化和蛋白激酶的参与,因此可能存在着复杂的信号传导级联反应,详细机制尚不清楚。目前S、Z基因的克隆和编码产物的鉴定均未有成功的报道,天蓝虉草可作为禾本自交不亲和性研究的一个模式作物,运用分离群体和比较基因组学方法构建S与Z位点的精细连锁图谱,以对自交不亲和基因进行图位克隆,是当前禾本科植物自交不亲和性研究的一个方向和热点。

成年大鼠骨骼肌干细胞纯化、培养及移植的初步实验研究

目的探讨成年大鼠骨骼肌干细胞纯化与培养方法及肌干细胞移植在肌疾病治疗中的价值。方法采用混合酶消化及反复差速贴壁法分离、纯化培养SD大鼠骨骼肌干细胞,然后用携带lac-Z基因的腺病毒载体转染肌干细胞,待转染成功后将携带lac-Z基因的骨骼肌干细胞注射于自体和同种异体的膀胱颈及后尿道周围,分别于注射后5、15d,处死大鼠取出膀胱颈及后尿道,行组织学检查及X-gal染色。结果成功地分离、培养了成年大白鼠的骨骼肌干细胞。注射部位无明显炎症改变,经X-gal染色显示自体细胞移植5d及15d均可见大量的蓝染细胞,提示移植细胞在体内成活,异体移植各时间点未见蓝染细胞。结论采用混合酶消化及差速贴壁的方法可以成功纯化骨骼肌干细胞;自体骨骼肌干细胞移植在体内可以存活,有可能成为治疗肌疾病的有效方法,而异体移植不能存活。

基于实时荧光定量PCR技术检测桑丁香假单胞菌

由桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori,以下简称Psm)引起的桑疫病是一种毁灭性的桑树细菌性病害,建立对病原菌的早期检测技术,有利于及时制定病害的防控技术措施。依据致病性相关基因hrp Z的片段设计的一对引物能够在Psm中特异性地扩增出195 bp大小的条带,而用于对其他致病变种的丁香假单胞菌和其他种属病原菌的扩增则没有此条带。利用Psm14-7菌株基因组DNA为模板进行实时荧光定量PCR(q PCR)扩增,模板DNA质量浓度在6×10^(-5)~6 ng/μL范围内与扩增所得Ct值呈现良好的线性关系,线性方程为y=-3.224 69x+14.034 45(R^2=0.997 09),检测的最低限为(60±0.001 2)fg/μL;以Psm14-7菌液为模板进行q PCR,菌液浓度在1×10~2~1×10~8CFU/m L范围内与Ct值呈现良好的线性关系,线性方程为y=-4.562 15x+46.911 67(R^2=0.988 72),最低检测限为(10~2±0.008 3)CFU/m L。于桑树植株人工接种Psm后不同时间,对出现各种症状植株中的菌群数量进行q PCR检测,结果显示:接种后的第4~8天可能为病原菌诱导桑树的过敏性反应和系统获得性抗性关键时期,影响到了Psm的增殖速度;能引起健康桑树暴发桑疫病的致病菌最低浓度为(1.5×10~8±0.076 8)CFU/g。建立的q PCR检测方法,对由Psm引起的桑疫病的田间早期诊断和及时防控具有一定指导意义。

利用超高密度Bin图谱定位高粱籽粒物理性状的QTL

高粱籽粒物理性状是影响酒用高粱酿造工艺的关键因素,定位影响这些性状的QTL/基因,对酒用高粱的遗传改良具有重要意义。本研究利用全基因组重测序技术,对来源于654与LTR108的244个家系的重组自交系群体(RIL)开展基因分析,构建了包含3418个Bin标记的高密度连锁遗传图谱。2021-2022年,在海南陵水和乐东调查了RIL群体的籽粒种果皮厚度和颜色。利用完备区间作图法(ICIM),在7条染色体(1~5、8、10)上共检测到25个QTLs与7个性状(外果皮厚度、中果皮厚度、果皮厚度、种皮厚度、子实皮厚度、外果皮颜色和种皮颜色)相关。1个位于2号染色体的重要QTL(57.83~57.96Mb)在多个性状和多个环境被重复检测到,与控制中果皮厚度的Z基因位点一致。在该位点附近发现了3个候选基因(Sobic.002G204200、Sobic.002G206700和Sobic.002G206750),与其他作物中编码泛素家族蛋白和多胺合成代谢相关蛋白的基因同源,参与调控种子大小形成。本研究为进一步开展Z基因克隆和分子标记辅助育种提供了理论依据。