猪ZFAND6基因克隆、序列分析及其多态位点检测

为了丰富猪ZFAND6基因研究的基础数据以及多态性分析,以‘申农猪’肝脏组织为材料,采用RTPCR和测序技术对猪ZFAND6基因CDS区进行扩增,使用ProtParam、PredictProtein、SWISS-MODEL等软件进行序列分析,并采用RFLP-PCR方法检测猪ZFAND6基因g.2395C>T位点和g.15060A>G位点在不同猪群体中的多态性。结果表明:获得猪ZFAND6基因长度为1097 bp,包括CDS区624 bp,共编码208个氨基酸残基,(A+T)含量高于(G+C)含量。猪ZFAND6蛋白为酸性蛋白质,氨基酸残基中Ser(15.38%)、Val(8.17%)及Gln(7.21%)的频率较高,属于不稳定类和可溶性蛋白。猪ZFAND6蛋白主要由α-螺旋、β折叠和无规卷曲构成,分布在细胞质、线粒体、溶菌体和内质网的比例分别为65%、10%、10%和15%,具有ZnF-A20结构域和ZnF-AN1结构域。猪ZFAND6蛋白氨基酸序列在不同物种之间同源性较高,在系统发育树中与牛、羊距离最近。ZFAND6基因g.2395C>T和g.15060A>G两个SNP位点在5个猪群体内表现出不同的遗传特点。在‘长白猪’群体中未检出g.2395C>T位点的TT型和g.15060A>G位点的不利基因型GG型,并且GG型在‘杜洛克猪’‘大白猪’‘申农猪’和‘梅山猪’群体中比例较低。

盐生草根系基因HgAKR6C的克隆与初步功能分析

醛酮还原酶(AKR)是构成Shaker型K+通道蛋白的保守核心结构域,在植物应对非生物胁迫时起到关键作用。本研究采用西北旱区典型盐生植物盐生草作为研究材料,基于课题组前期盐生草根系盐胁迫转录组学数据分析结果,筛选并克隆得到耐盐基因HgAKR6C。HgAKR6C基因蛋白质编码区(CDS)全长951 bp,共编码氨基酸317个。系统发育进化树分析表明,HgAKR6C与拟南芥中AtAKR6C1基因亲缘关系最近。亚细胞定位表明该基因可能主要定位于细胞质和细胞核中。qRT-PCR结果表明HgAKR6C在盐处理24 h时表达量达到峰值。构建酵母异源表达载体转化缺陷型菌株发现,HgAKR6C基因可能参与Na+的外排和介导K+的吸收。综上所述,HgAKR6C具有调节盐生草耐盐性的功能,而盐生草根系耐盐基因HgAKR6C的调控机制还需进一步的研究验证。

杨树桑黄6-磷酸海藻糖合成酶基因克隆鉴定与表达分析

对杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)6-磷酸海藻糖合成酶基因(SvTPS)进行克隆和生物信息学分析,并进行原核表达;采用荧光定量PCR方法研究SvTPS在杨树桑黄菌丝体和不同年份子实体中的表达情况,测定菌丝体和不同年份子实体中SvTPS活性。结果表明:SvTPS DNA序列长度为1894 bp,编码576个氨基酸。SvTPS相对分子质量为65130,等电点为6.21,脂肪系数为88.14,平均亲水系数为-0.281,不稳定系数为42.41。SvTPS氨基酸序列与暴马桑黄(S.baumii)的相似性最高,仅有一个TPS单结构域;SvTPS二级结构中α-螺旋、β-折叠、延伸链、无规卷曲占比分别为48.61%、5.56%、15.62%、30.21%。三年生子实体SvTPS的表达量最高,菌丝体的表达量最低。菌丝体的SvTPS活性最低;随着栽培时间增加,SvTPS活性增加,三年生子实体的最高。研究结果为进一步探讨SvTPS在杨树桑黄生长发育过程中的功能提供参考。

马铃薯StNAC6基因克隆及干旱胁迫表达分析

NAC对植物种子发育、细胞分裂分化、侧根形成等都有直接影响,它与DNA元件相结合发挥作用,能够有效提高植物的抗逆性。通过PCR方法从马铃薯冀张薯8号中克隆获得了1个StNAC6基因,并对StNAC6基因进行生物信息学分析,包含序列比对、理化性质预测、进化分析等。使用冀张薯8号组培苗作为试验材料,用浓度为10%、15%和20%的聚乙二醇6000(PEG-6000)处理0、6、12、24 h后,分析干旱胁迫下的表达模式,并在马铃薯开花期,采取不同的组织(花、根、茎、叶、块茎、葡匐茎)进行组织表达分析。结果表明,马铃薯NAC6基因全长为876 bp,共编码291个氨基酸,包含1个NAM结构域;等电点为7.04,相对分子量为33.61915 ku;StNAC6蛋白均含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3种氨基酸磷酸化位点,属于不稳定亲水性蛋白;StNAC6第74、262位氨基酸存在N-糖基化位点;预测StNAC6定位于细胞核。荧光定性PCR结果显示,在不同含量PEG胁迫处理下,马铃薯StNAC6基因的相对表达量不相同,存在明显差异,说明该基因参与干旱应答响应;StNAC6基因在马铃薯茎、花中的相对表达量最高,说明其可能参与马铃薯生长调控。研究结果可为今后深入探究马铃薯NAC6转录因子的功能和调控机制奠定基础。

番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sg RNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sg RNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sg RNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-6的克隆、序列分析和组织表达

本文利用RT-PCR和RACE方法,获得了家蚕Bombyxmori丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(serpin)的开放读码框(ORF)和5′UTR序列。根据该基因与其他昆虫serpin的同源性关系将其命名为家蚕serpin-6基因,GenBank登录号EU159447。为了研究serpin-6与家蚕免疫反应的相关机理,对serpin-6基因的组织表达和免疫刺激反应进行了研究。结果表明该基因在家蚕的头部和生殖腺中mRNA表达量非常高,在中肠,脂肪体,丝腺和血淋巴表达量较低。用脂多糖(LPS)刺激5龄第3d家蚕后,serpin-6基因在脂肪体和血淋巴中都被显著诱导表达,且都在刺激6h后表达量最高。推测该基因在家蚕细胞免疫反应中起着一定的作用。

用克隆池PCR法筛选小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL基因组TAC文库获得抗病基因候选克隆

用根据抗病基因保守区设计的一对简并性引物 ,从小麦 簇毛麦易位系 6VS 6ALcDNA中PCR扩增获得一个具有抗病基因核苷酸结合位点 (Nucleotidebindingsite,NBS)结构特点的DNA片段克隆N7。从小麦 簇毛麦易位系6VS 6AL基因组TAC(Transformation competentartificialchromosome,TAC)文库的 2 2块 96孔板提取所有 2 112个克隆池(每个池含约 10 0 0个克隆 )的质粒 ,再根据N7的核苷酸序列设计一对特异引物 ,用克隆池PCR(pooledPCR)法经分级筛选从文库中获得一个阳性克隆。以N7为探针 ,通过Southern杂交证实了该TAC克隆为真正含有抗病候选基因的克隆。

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC50为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。

鸡白介素-6(ChIL-6)基因的克隆与序列分析

分别用鸡传染性法氏囊病病毒感染和用ConA免疫刺激健康鸡 ,无菌取处理鸡的脾脏 ,匀浆后用Tr izol抽提细胞总RNA ,应用随机引物反转录获得cDNA ,设计引物 ,经PCR扩增获得鸡白介素 - 6 (ChIL - 6 )基因 ,应用pGEM -T载体克隆该基因 ,经测序 ,表明其与GeneBank中公布的唯一的一个ChIL - 6基因为同源基因。

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ，Ｃ１８：３△６，９，１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ，Ｃ１８：２△９，１２）为底物，在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中，γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物，而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物，利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ，全长为１３７４个核苷酸，编码４５７ 个氨基酸，但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是， △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。

鸭瘟病毒北京株UL6和UL7基因的克隆及序列测定

依据文献报道的鸭瘟病毒 (DPV)的核苷酸序列 ,设计和合成了二对引物 ,分别为SP1和SP2 ,LP1和LP2。北京株鸭瘟病毒于鸭胚中增殖 ,差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化 ,按酚 氯仿法抽提DNA。然后以DPVDNA为模板进行PCR ,分别扩散增出与理论相符的 42 1bp和 1 2 0 9bp的二个DNA片段 ,并将它们克隆于质粒pGEM TEasy中。经酶切和质粒PCR ,筛选含有目的基因的重组质粒。重组质粒以步移法从双方向测序 ,获 1 586bp的核苷酸序列。研究发现这 1 586bp的核苷酸序列与文献报道的UL6和UL7基因序列的同源性为 99% ,仅有一个碱基的差异。进一步作氨基酸分析 ,发现这个碱基所引起的变异为无意义突变 (CCT→CCC)。结果表明 。

盐芥谷胱甘肽过氧化物酶基因(ThGPX6)的克隆及表达分析

谷胱甘肽过氧化物酶在植物响应盐胁迫中具有重要作用。依据盐芥EST序列进行RACE实验,获得1个新的谷胱甘肽过氧化物酶基因,命名为ThGPX6(GenBank注册号为FJ357244)。该基因的cDNA全长892 bp,包含1个长为702bp的开放读码框,编码234个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白具有植物GPX的典型结构,即GPX催化活性区(NVASKCGLT)和标志性基序(ILAFPCNQF),以及PHGPX特有序列(KWNF(S/T)KFL)。实时荧光定量PCR分析结果表明,ThGPX6在盐芥叶片和根中表达,其表达受NaCl诱导,显示ThGPX6在植物高盐响应中发挥作用。亚细胞定位结果表明,ThGPX6存在于线粒体和内体中的可能性最大,预示着ThGPX6在清除ROS过程中起着重要作用。

高血压患者及大鼠线粒体ATPase 6基因的克隆、表达与突变研究

目的：研究正常血压与高血压鼠以及正常血压与高血压患者的差异基因。方法：用差别杂交法（Differentialhybridization）筛选正常人心脏cDNA文库的部分克隆，得到多个在自发性高血压鼠（SHR）心肌和高血压患者外周白细胞中高表达的线粒体基因。重组质粒，PCR－SSCP和测序，进行基因突变分析。结果：SHR鼠心肌线粒体ATPase6基因构象改变,8701位碱基由G→A（G8701A），编码的第59位氨基酸密码子由丙氨酸变成苏氨酸；A8708G，编码的第61位氨基酸由组氨酸变成精氨酸。高血压病患者外周血白细胞线粒体ATPase6基因8584位碱基突变（G8584A），编码的第20位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸，这一变化与SHR线粒体ATPase6基因改变相一致。结论：高血压病患者外用血白细胞线粒体ATPase6基因G8584A突变很可能在高血压病心肌肥厚的发生、发展中具有意义，并可能是高血压病的特异性改变。

牛丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6同源基因的克隆化研究

目的 利用不同种属动物之间重要基因序列高度同源的理论 ,应用生物信息学技术和方法 ,克隆牛丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白结合蛋白 6 (HCBP6 )的同源基因。方法 首先应用酵母双杂交技术 ,以表达HCV核心蛋白的表达载体为诱饵 ,对于百万级的肝细胞cDNA文库酵母进行配合、筛选 ,首先获得人HCBP6的全长编码基因 ,然后应用美国国立生物信息学中心 (NCBI)建立的核苷酸序列数据库 (GenBank)的同源基因的检索 ,搜索与之同源的来源于牛的表达序列标签 (EST)。然后根据基因同源性的原则 ,确定牛HCBP6的同源基因。结果 获得了与HCV核心蛋白结合蛋白的 36个基因片段 ,其中之一命名为HCBP6。根据基因同源性搜索 ,获得了来源于牛的EST基因序列片段 ,最终确立了牛HCBP6的同源基因。结论 利用不同物种之间基因同源性的原理 ,NCBI数据库GenBank同源基因的搜索 ,获得了牛HCBP6同源基因。生物信息学技术在后基因组时代具有重要地位和作用。

甘薯U6启动子克隆及其转录活性分析

在CRISPR/Cas9基因编辑系统中,U6启动子可以通过驱动sgRNA的表达来编辑目的基因,因而其转录活性会影响基因编辑效率。尽管人们已经在拟南芥、玉米、大豆、棉花等植物中开展了U6启动子的克隆与应用研究,然而目前在甘薯中U6启动子的相关研究还未见报道。本研究利用拟南芥的AtU6 SnRNA的保守序列在三浅裂野牵牛(Ipomoea trifida)基因组数据库中搜索候选U6 RNA,然后在其上游搜索到2个不同的候选U6启动子,长度分别为526 bp(IbU6p-1)和532 bp(IbU6p-2);序列比对分析结果显示,甘薯的U6启动子具有上游序列元件(USE)以及TATA-box,其序列也与拟南芥高度相似。然后,利用获得的U6启动子核酸序列构建了能够驱动萤火虫荧光素酶基因(LUC)表达的重组框U6::LUC。最后,将含有上述重组载体的根癌农杆菌瞬时转化到本氏烟草叶片和甘薯愈伤组织中,并通过荧光成像技术分析荧光素酶活性。结果发现,在烟草及甘薯愈伤组织中2个甘薯U6启动子均能驱动LUC基因表达,具有转录活性。同时,IbU6p-2的转录活性无论是在烟草叶片中还是在甘薯愈伤组织中都显著高于拟南芥U6启动子。本研究结果为进一步发展甘薯基因编辑技术提供了参考。

重瓣百合LiAGL6基因的克隆与表达分析

为了深入研究重瓣百合花形成的分子机制,以重瓣百合比罗尼卡为试验材料,从中分离得到1个AGL6基因,其开放阅读框为744 bp,共编码247个氨基酸,蛋白质分子量为28.3 ku。亲水性平均系数为-0.748,等电点为8.23。蛋白结构分析显示,百合AGL6蛋白具有典型的MADS-box结构域、K-box区及2个AGL6基序。系统进化树分析结果显示,百合AGL6编码的蛋白属于AP1/AGL9亚家族AGL6分枝的单子叶植物类群,与同为单子叶植物的风信子亲缘关系最近,相似度达到78%,说明克隆得到的基因即为AGL6的同源基因,将其命名为LiAGL6。亚细胞定位表明,LiAGL6在洋葱表皮细胞的细胞核中表达,具备转录因子的基本特征。实时荧光定量PCR结果分析表明,LiAGL6基因在花中表达量最高,在茎、叶中几乎不表达;在整朵花中,LiAGL6在第7轮花瓣中的相对表达量最高,其次依次是第6轮和第3轮,第2轮花瓣中几乎检测不到表达。研究表明,LiAGL6基因可能在百合重瓣花形成方面发挥了调控作用。

家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6u1的克隆、序列分析与表达谱

细胞色素P450第6亚家族基因为昆虫所特有,与抗性相关。为了检测家蚕Bombyx mori cyp6u1基因是否与耐氟性相关,首先克隆了cyp6u1基因。采用生物信息学方法获得与黑腹果蝇Drosophila melanogaster cyp6u1基因同源的家蚕B.moricyp6u1基因序列,预测该序列的开放阅读框(ORF)为1476bp,编码491个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为56.15kD,等电点为9.23。以家蚕5龄第3天幼虫精巢cDNA为模板,设计特异引物PCR扩增出一条约1500bp的条带,大小与家蚕cyp6u1序列的ORF预测值接近,命名为Bmcyp6u1基因(GenBank登录号:HM130560)。同源性分析表明,Bmcyp6u1基因与蜜蜂Apis mellifera的同源基因cyp6AS13的相似性为56%,与拟南芥Arabidopsis thaliana的cyp72A82的相似性为48%,与人Homosapiens的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明,Bmcyp6u1基因在家蚕5龄第3天幼虫各组织表达量很低,只在精巢组织(5龄第3天)稍有表达,推测该基因具有组织特异性。

鲤Myf-6基因的克隆及其表达分析

根据斑马鱼（Danio rerio）Myf-6基因序列设计引物,用鲤（Cyprinus carpio）肌肉组织总RNA,经RT-PCR扩增获得Myf-6基因开放阅读框（ORF序列）720 bp,GenBank登陆号为GU339054。编码239个氨基酸,与斑马鱼、大西洋鲑、刀鱼、河豚等同源性分别为90%、76%、76%和72%,但与哺乳动物如人、牛、兔、小鼠和绵羊的同源性较低,为59%~60%。利用半定量RT-PCR分析鲤Myf-6基因的mRNA表达特性,结果在心脏、肾脏、脂肪、肝胰脏、肌肉和脾脏中均检测到Myf-6基因的表达,并且在肌肉组织中表达量显著高于其他组织（P〈0.05）。Myf-6基因表达随着生长发育变化呈下降趋势,在较大规格试验鱼（500 g）的表达极显著低于其他两种规格（50~60 g1、20~130 g）试验鱼的表达（P〈0.01）。

猪轮状病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因VP6cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni2+金属螯合亲合层析纯化融合蛋白。结果表明,VP6基因全长1356bp,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量可占菌体蛋白的26.5%,在表达的蛋白中,除45ku主要蛋白外,还有几条分子量较小的蛋白表达出来,这些融合蛋白经纯化后均具有良好的反应特异性。

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达

以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和