锌指基因ZFP580在大鼠心肌缺血损伤中的表达

【目的】观察大鼠ZFP580基因在急性心肌缺血的不同时期的表达变化,以初步探讨锌指基因ZFP580在心肌缺血损伤中的作用。【方法】腹腔注射异丙肾上腺素(ISO)建立大鼠急性心肌缺血模型,分别于ISO注射后1h、24h取材,对照组腹腔注射等量生理盐水。观察心肌形态学改变,检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)及肌酸激酶(CK)的含量,半定量RT-PCR及免疫组化方法分析ZFP580 mRNA及蛋白水平的表达变化。【结果】ISO处理组大鼠心肌组织广泛缺血损伤,血清LDH、CK含量明显升高(P<0.05),心室肌ZFP580mRNA表达下调(P<0.05),免疫组化染色阳性细胞百分率明显降低,以ISO注射1h后变化更为明显。【结论】ZFP580是心肌缺血损伤的早期调控基因之一,其表达下调可能参与了心肌缺血损伤的形成。

C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因的克隆及序列分析

【目的】克隆C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因cDNA序列,并进行序列测定和分析。【方法】参照GENBANK公布的C57BL/6小鼠ZFP580 cDNA序列(注册号为AK005257),根据ZFP580 C端编码基因cDNA序列设计1对引物,采用RT-PCR技术,从C57BL/6小鼠的肾脏组织中扩增ZFP580 C端编码基因cDNA序列,回收纯化后与T载体连接,构建重组子pMD18-T-ZFP580,转化大肠杆菌DH5α。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后,测定序列并分析。【结果】自C57BL/6小鼠肾脏组织获得总RNA,扩增出255 bp的基因片段,成功构建阳性克隆重组子pMD-T-ZFP580,经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的C57BL/6小鼠ZFP580 C端基因cDNA序列与日本RIKEN基因组中心于GENBANK注册(注册号为AK005257)的完全一致,与人ZNF580 C端编码基因cDNA序列比较,核苷酸序列同源性为90%;该cDNA序列所编码的氨基酸序列与人ZNF580基因C端比较,同源性为100%,均编码有3个串联重复的C2H2型锌指蛋白主构域。其氨基酸序列与大鼠、犬、牛比较,同源性分别为100%、100%、98%。【结论】成功克隆C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因,该基因在不同种属间高度保守。

雌激素对去势高脂血症C57BL/6模型小鼠ZFP580 mRNA表达的影响

目的探讨雌激素对C57BL/6小鼠主动脉中ZFP580基因表达的影响。方法建立假手术组、去势对照组(卵巢切除)、去势实验组(卵巢切除并腹腔内注射苯甲酸雌二醇)C57BL/6小鼠高脂血症模型并鉴定;提取C57BL/6小鼠主动脉总RNA,设计并合成ZFP580及β-actin基因的引物,利用半定量RT-PCR方法分析ZFP580的mRNA水平。结果成功构建去势C57BL/6小鼠高脂血症模型;去势对照组小鼠ZFP580基因表达水平与假手术组和实验组相比均下降(P<0.05),而后两者表达水平比较无显著差异(P>0.05)。结论小鼠在摘除卵巢失去雌激素的调控后,ZFP580基因表达下调,小鼠在去势后定期给予雌激素,ZFP580基因表达回复至假手术组水平,说明雌激素能够上调ZFP580基因表达。

ZFP580基因在高脂血症小鼠主动脉组织中的表达

目的探讨ZFP580基因在高脂血症小鼠主动脉组织中的表达情况。方法将40只C57BL/6小鼠随机分为正常对照组和高脂血症组。采用逆转录PCR方法,检测2组小鼠主动脉组织中ZFP580的表达。结果 ZFP580在两组小鼠的主动脉组织中均有表达,而高脂血症组表达量明显低于对照组(P<0.01)。结论血脂升高使ZFP580在C57BL/6小鼠主动脉组织中表达明显下调,表明ZFP580表达改变与高脂血症的发生存在一定关系。

基于基因表达数据库的鼠ZFP580基因功能分析

基因表达数据库（gene expression omnibus,GEO）是美国国立生物技术信息中心（National Center for biotechnology information,NCBI）在2000年7月首次公布的基因表达相关数据的公共贮存平台。2005年,NCBI等四家科研机构联合统计表明：GEO拥有代表100多种生物体的近10亿个单独的基因表达数据信息，每周有1000多个不同的用户访问GEO，整体GEO网站的访问次数每周已超过15000次。

锌指蛋白ZFP580在全反式维甲酸调节大鼠血管平滑肌细胞迁移中的作用及机制

目的:探讨锌指基因ZFP580在全反式维甲酸(ATRA)调节VSMCs迁移功能中的作用及其机制。方法:分离,培养并鉴定大鼠主动脉VSMCs;分别予以0、5、10、20μmol/L ATRA刺激VSMCs 24h,以0μmol/L ATRA组为对照组,观察不同溶度ATRA刺激不同时间对VSMCs迁移能力的影响或给予0、20μmol/L ATRA刺激VSMCs 24、48、72h,观察ATRA刺激不同时间对VSMCs迁移能力的影响;QPCR及Western blot检测ATRA刺激VSMCs后ZFP580的mRNA和蛋白表达变化;应用ERK抑制剂PD98059抑制ERK的蛋白表达,观察ERK信号蛋白表达变化对ATRA刺激后ZFP580蛋白表达的影响;腺病毒转染技术获得过表达或低表达ZFP580的VSMCs,QPCR及Western blot检测MMP-2和MMP-9、ZFP580蛋白和mRNA表达水平。结果:分离的VSMCs在培养10d后,免疫荧光显示平滑肌细胞特异性标记物SM22α抗体阳性。与对照组相比,5、10、20μmol/L ATRA预刺激分别降低了32%、43%和59%的VSMCs迁移能力;20μmol/L ATRA刺激VSMCs与对照组相比,在24、48、72h分别降低49%、36%和22%细胞迁移能力。ZFP580的mRNA和蛋白表达随着ATRA刺激溶度的增加和刺激时间的延长而升高。ERK在ATRA刺激15min即显著升高,运用ERK抑制剂PD98059(20μmol/L)预处理抑制ERK蛋白表达并降低了ATRA诱导ZFP580的蛋白表达。过表达ZFP580降低MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达,反之,低表达ZFP580则上调了MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达。结论:ATRA可通过ERK信号通路上调ZFP580的表达,而ZFP580通过调控MMP-2和MMP-9的表达参与ATRA对VSMCs迁移的抑制作用。

背部皮下注射过表达ZFP580基因转染的EPCs介导裸鼠局部血管生成情况观察

目的观察过表达ZFP580基因对内皮祖细胞(EPCs)介导的裸鼠局部血管生成的影响。方法采用Ficoll密度梯度离心法分离提取大鼠骨髓来源的EPCs,以腺病毒为载体构建过表达ZFP580基因质粒(Ad-ZFP580)、低表达ZFP580基因质粒(Ad-siZFP580)。将EPCs分为Ad-ZFP580组、Ad-siZFP580组、过表达病毒空载质粒(Ad-NC)组、低表达病毒空载质粒(Ad-si-scrambled)组,并分别转染Ad-ZFP580(MOI=10)、Ad-siZFP580(MOI=50)、Ad-NC、Ad-si-scrambled(后两组为对照组),qRT-PCR、Western blotting法检测各组转染的EPCs中ZFP580 mRNA及蛋白相对表达量,证实腺病毒成功转染EPCs。分别将各组转染的EPCs细胞悬液与Matrigel胶混合,并注射至裸鼠的背部皮下,7 d后取裸鼠背部皮下胶体,采用HE染色观察裸鼠背部皮下胶体血管管腔生成数目,免疫组化vWF染色检测管腔vWF阳性结构数目。结果Ad-ZFP580组、Ad-NC组胶体中血管管腔生成数目分别为(4.83±0.75)、(2.00±0.63)个,Ad-siZFP580组、Ad-si-scrambled组胶体中血管管腔生成数目分别为(0.50±0.55)、(2.17±0.41)个,Ad-ZFP580组、Ad-NC组比较,Ad-siZFP580组、Ad-si-scrambled组比较,P均<0.05。Ad-ZFP580组、Ad-NC组胶体中胶体中血管管腔的vWF阳性结构数目分别为(4.67±0.82)、(1.83±0.41)个,Ad-siZFP580组、Ad-si-scrambled组胶体中胶体中血管管腔的vWF阳性结构数目分别为(0.67±0.52)、(1.83±0.75)个,Ad-ZFP580组、Ad-NC组比较,Ad-siZFP580组、Ad-si-scrambled组比较,P均<0.05。结论过表达ZFP580基因可增加EPCs介导的裸鼠局部血管管腔生成数目及管腔vWF阳性结构数目,相反则抑制,其可能在EPCs介导的血管生成过程中起着重要调控作用。

体外胰腺腺泡细胞炎性反应中ZFP580与内质网应激的相互作用

目的探讨锌指蛋白ZFP580在体外蛙皮素诱导的胰腺腺泡细胞炎性反应过程中通过内质网应激通路发挥作用的机制,为急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)发病机制提供新的认识。方法用蛙皮素体外刺激AR42J细胞,模拟AP过程中胰腺腺泡细胞的炎性反应状态,用MTT法测定细胞活力以确定蛙皮素的最佳诱导时间;分别用RT-PCR和Western Blot检测细胞中内质网应激相关分子和ZFP580的mRNA和蛋白表达;应用IRE1抑制剂MKC-3946干预AR42J细胞,观察ZFP580表达变化;最后用慢病毒转染方法沉默ZFP580后,用Hochest33342染色和RT-PCT、Western Blot评价其对细胞凋亡-坏死的影响。结果以蛙皮素刺激后诱导AR42J细胞发生内质网应激,ZFP580表达在刺激8 h后开始升高,呈时间依赖性上升;应用MKC-3946后,ZFP580的表达显著降低;沉默ZFP580后,XBP-1s表达下降,同时沉默ZFP580组的Chop表达量要显著高于对照组,而Caspase-3的表达显著低于普通AP组;Hochest染色观察发现沉默ZFP580组的坏死细胞比例要显著高于普通AP组。结论ZFP580在胰腺腺泡细胞内质网应激信号通路中的位置可能位于IRE1与XBP-1s之间,其可能通过改善凋亡-坏死比例,对减轻AP炎性反应有一定作用。

ZFP580基因过表达对大鼠骨髓源性内皮祖细胞分化的影响

【目的】内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)参与血管内皮修复及血管新生,EPCs分化受多种转录因子调控网络的影响,本实验旨在研究新型C2H2锌指蛋白基因ZFP580对EPCs分化作用的影响。【方法】密度梯度离心法,分离培养大鼠骨髓源性EPCs,免疫荧光染色鉴定EPCs;腺病毒转染过表达ZFP580的EPCs,QPCR及Western blotting检测ZFP580对EPCs分化的影响。【结果】细胞培养至7 d时,Dil-ac LDL/FITC-UEA-I双阳性细胞约占87.39%±2.98%。证实所培养细胞为EPCs。腺病毒转染技术获得过表达ZFP580的EPCs,ZFP580基因过表达促进成熟内皮表型CD31和v WF的表达。【结论】ZFP580基因过表达促进EPCs向成熟血管内皮细胞分化,提示ZFP580基因在EPCs分化过程中起重要的调控作用。

NF-κB/ZFP580通路在高原脑水肿中的调控作用

【目的】探讨NF-κB/ZFP580通路在高原脑水肿中的调控作用。【方法】将小鼠随机分为3组:空白组,12 h急性缺氧组,24 h急性缺氧组。采用免疫组化观察小鼠脑组织ZFP580、VEGF和NF-κB分布及表达情况;采用Western blotting技术检测小鼠脑组织ZFP580、VEGF和NF-κB蛋白的表达;采用Real Time-PCR技术检测小鼠脑组织ZFP580、VEGF和NF-κB mRNA表达变化。【结果】ZFP580主要分布于血管内皮细胞、星型胶质细胞。VEGF主要分布于神经元、血管内皮细胞、星形胶质细胞。NF-κB主要分布于血管内皮细胞、星形胶质细胞。急性低压低氧处理后ZFP580、VEGF和NF-κB的蛋白及mRNA表达增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】NF-κB/ZFP580通路参与了VEGF的调控,在高原脑水肿的形成过程中起了重要作用。

锌指蛋白ZFP580在低剪切应力诱导的动脉粥样硬化斑块中的表达

【目的】通过观察由低血流剪切应力诱导的小鼠颈总动脉粥样硬化斑块中锌指蛋白ZFP580的表达,探讨其在动脉粥样硬化病变中的作用。【方法】建立颈总动脉局部狭窄动物模型,HE染色观察局部狭窄血管远心端的形态学改变,RT-PCR方法检测动脉组织中ZFP580 mRNA的表达,免疫组织化学染色观察锌指蛋白ZFP580在病变处的表达。【结果】小鼠左颈总动脉局部狭窄2周后,远心端血管内膜增厚(P<0.05),且随处理时间的延长内膜增厚愈加明显(P<0.01),处理3周后,可见明显的动脉粥样硬化斑块。RT-PCR及免疫组织化学染色发现病变动脉中ZFP580的表达较未处理侧明显升高(P<0.01),且ZFP580阳性细胞多集中在内膜层。【结论】ZFP580可能在低剪切应力诱导的动脉粥样硬化斑块的形成及发展中发挥重要的调控作用。

转录因子ZFP580对大鼠星形胶质细胞中活性依赖的神经保护蛋白表达的影响

【目的】研究锌指转录因子ZFP580对大鼠星形胶质细胞中活性依赖的神经保护蛋白(activity-dependent neuroprotective protein,ADNP)表达的影响。【方法】培养大鼠星形胶质细胞,分别以不同浓度TGF-β1和SB431542刺激细胞一定时间后,RTPCR、Western blotting检测ZFP580和ADNP的表达。再以同一浓度TGF-β1和SB431542刺激细胞不同时间后,RT-PCR、Western blotting检测ZFP580和ADNP的表达。【结果】不同浓度TGF-β1刺激4 h后,ZFP580和ADNP mRNA和蛋白的表达均随TGF-β1浓度的升高而上升;同一浓度TGF-β1刺激细胞不同时间后,ZFP580和ADNP mRNA和蛋白的表达呈先上升后下降的趋势;不同浓度SB431542刺激细胞6 h后,ZFP580和ADNP mRNA和蛋白的表达均随SB431542浓度的升高而降低;同一浓度SB431542刺激细胞不同时间后,ZFP580和ADNP mRNA和蛋白的表达总体呈逐渐下降趋势。【结论】转录因子ZFP580在调节神经胶质细胞ADNP的表达中具有重要作用,其机制可能通过活化了TGF-β1/ALK5/Smad2/3信号通路。

siRNA腺病毒载体沉默ZFP580基因对EPCs介导的血管生成的影响

【目的】研究siRNA腺病毒载体沉默ZFP580基因对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)介导的血管生成的影响,初步探讨锌指转录因子ZFP580基因在血管生成中的生物学效应。【方法】分离培养并鉴定大鼠骨髓源性EPCs;ZFP580-siRNA腺病毒表达载体转染EPCs;QPCR及Western blotting检测EPCs中ZFP580基因的表达;应用体外血管生成实验,检测ZFP580基因对EPCs介导的血管生成能力的影响。【结果】分离的EPCs培养至7 d时,免疫荧光示CD31、VEGFR-2表达阳性,CD45表达阴性,证实所分离培养的细胞是EPCs。ZFP580基因低表达可显著抑制体外血管生成。【结论】siRNA腺病毒载体沉默ZFP580基因可抑制EPCs介导的血管生成,转录因子ZFP580对内皮祖细胞的分化及血管生成过程中起着重要的调控作用。

锌指基因ZFP580通过eNOS/NO信号通路促进EPCs分化的作用机制

【目的】探讨C2H2型锌指基因ZFP580调控EPCs分化的作用机制。【方法】分离、培养并鉴定大鼠骨髓源性EPCs;腺病毒转染技术获得过(低)表达ZFP580的EPCs;QPCR、Western blotting及体外血管新生实验检测ZFP580对EPCs分化及血管生成能力的影响;应用NO供体SNAP及e NOS抑制剂L-NAME探讨e NOS/NO信号通路在ZFP580调控EPCs分化过程中的作用。【结果】ZFP580过表达促进e NOS表达,同时成熟内皮细胞标志物CD31、vWF表达升高,体外血管生成能力增强,NO生物利用度及胞内cGMP含量显著升高;NO供体SNAP显著提高CD31和vWF蛋白表达水平及体外血管生成能力,而NOS抑制剂L-NAME则显著抑制ZFP580诱导的CD31和vWF蛋白表达水平及体外血管生成能力,并削弱ZFP580诱导的NO及胞内cGMP的表达。【结论】ZFP580可通过激活e NOS/NO途径诱导e NOS表达,提高NO活性及胞内cGMP含量,增加体外血管生成,促进EPCs向成熟ECs分化。