背部皮下注射过表达ZFP580基因转染的EPCs介导裸鼠局部血管生成情况观察

目的观察过表达ZFP580基因对内皮祖细胞(EPCs)介导的裸鼠局部血管生成的影响。方法采用Ficoll密度梯度离心法分离提取大鼠骨髓来源的EPCs,以腺病毒为载体构建过表达ZFP580基因质粒(Ad-ZFP580)、低表达ZFP580基因质粒(Ad-siZFP580)。将EPCs分为Ad-ZFP580组、Ad-siZFP580组、过表达病毒空载质粒(Ad-NC)组、低表达病毒空载质粒(Ad-si-scrambled)组,并分别转染Ad-ZFP580(MOI=10)、Ad-siZFP580(MOI=50)、Ad-NC、Ad-si-scrambled(后两组为对照组),qRT-PCR、Western blotting法检测各组转染的EPCs中ZFP580 mRNA及蛋白相对表达量,证实腺病毒成功转染EPCs。分别将各组转染的EPCs细胞悬液与Matrigel胶混合,并注射至裸鼠的背部皮下,7 d后取裸鼠背部皮下胶体,采用HE染色观察裸鼠背部皮下胶体血管管腔生成数目,免疫组化vWF染色检测管腔vWF阳性结构数目。结果Ad-ZFP580组、Ad-NC组胶体中血管管腔生成数目分别为(4.83±0.75)、(2.00±0.63)个,Ad-siZFP580组、Ad-si-scrambled组胶体中血管管腔生成数目分别为(0.50±0.55)、(2.17±0.41)个,Ad-ZFP580组、Ad-NC组比较,Ad-siZFP580组、Ad-si-scrambled组比较,P均<0.05。Ad-ZFP580组、Ad-NC组胶体中胶体中血管管腔的vWF阳性结构数目分别为(4.67±0.82)、(1.83±0.41)个,Ad-siZFP580组、Ad-si-scrambled组胶体中胶体中血管管腔的vWF阳性结构数目分别为(0.67±0.52)、(1.83±0.75)个,Ad-ZFP580组、Ad-NC组比较,Ad-siZFP580组、Ad-si-scrambled组比较,P均<0.05。结论过表达ZFP580基因可增加EPCs介导的裸鼠局部血管管腔生成数目及管腔vWF阳性结构数目,相反则抑制,其可能在EPCs介导的血管生成过程中起着重要调控作用。

C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因的克隆及序列分析

【目的】克隆C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因cDNA序列,并进行序列测定和分析。【方法】参照GENBANK公布的C57BL/6小鼠ZFP580 cDNA序列(注册号为AK005257),根据ZFP580 C端编码基因cDNA序列设计1对引物,采用RT-PCR技术,从C57BL/6小鼠的肾脏组织中扩增ZFP580 C端编码基因cDNA序列,回收纯化后与T载体连接,构建重组子pMD18-T-ZFP580,转化大肠杆菌DH5α。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后,测定序列并分析。【结果】自C57BL/6小鼠肾脏组织获得总RNA,扩增出255 bp的基因片段,成功构建阳性克隆重组子pMD-T-ZFP580,经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的C57BL/6小鼠ZFP580 C端基因cDNA序列与日本RIKEN基因组中心于GENBANK注册(注册号为AK005257)的完全一致,与人ZNF580 C端编码基因cDNA序列比较,核苷酸序列同源性为90%;该cDNA序列所编码的氨基酸序列与人ZNF580基因C端比较,同源性为100%,均编码有3个串联重复的C2H2型锌指蛋白主构域。其氨基酸序列与大鼠、犬、牛比较,同源性分别为100%、100%、98%。【结论】成功克隆C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因,该基因在不同种属间高度保守。

雌激素对去势高脂血症C57BL/6模型小鼠ZFP580 mRNA表达的影响

目的探讨雌激素对C57BL/6小鼠主动脉中ZFP580基因表达的影响。方法建立假手术组、去势对照组(卵巢切除)、去势实验组(卵巢切除并腹腔内注射苯甲酸雌二醇)C57BL/6小鼠高脂血症模型并鉴定;提取C57BL/6小鼠主动脉总RNA,设计并合成ZFP580及β-actin基因的引物,利用半定量RT-PCR方法分析ZFP580的mRNA水平。结果成功构建去势C57BL/6小鼠高脂血症模型;去势对照组小鼠ZFP580基因表达水平与假手术组和实验组相比均下降(P<0.05),而后两者表达水平比较无显著差异(P>0.05)。结论小鼠在摘除卵巢失去雌激素的调控后,ZFP580基因表达下调,小鼠在去势后定期给予雌激素,ZFP580基因表达回复至假手术组水平,说明雌激素能够上调ZFP580基因表达。