干扰牛Zfy基因的载体构建及其在细胞水平上的效果验证

重组载体可以靶向干扰公牛睾丸中Zfy基因的表达,从而影响Y精子的发育和形成过程,引起睾丸中X、Y精子的比例发生偏移。本试验用pLL3.7质粒重组构建3个牛Zfy基因mRNA干扰载体,即pLL3.7/a、pLL3.7/b、pLL3.7/c。同时设置空白对照(等体积生理盐水)、空载体(无干扰片段)等作为对照组,建立生殖细胞系的体外培养体系,用脂质体2000将质粒载体转染到生精细胞,运用RT-qPCR、免疫印迹(Western Blot,WB)方法从细胞水平上筛选出效果最佳的干扰载体。结果表明,同对照组相比,pLL3.7/a能使Zfy基因mRNA表达水平下降68.65%±7.25%(P<0.01);pLL3.7/c能使Zfy基因mRNA表达水平下降23.36%±3.67%(P<0.05);pLL3.7/b能使Zfy基因mRNA表达水平下降11.01%±2.14%(P>0.05)。WB试验与RT-qPCR检测结果一致,因此,pLL3.7/a干扰效果最佳。本研究结果将为从基因层面实现性别控制技术的研发和奶牛养殖业的发展提供技术支撑。

体内干扰Zfy基因对驴精子发育相关基因表达的影响

【目的】研究体内干扰Zfy基因对驴睾丸、附睾组织中Zfy蛋白表达以及精子发育相关基因表达的影响。【方法】选取健康种公驴,将一侧睾丸注射空载体作为对照组,另一侧睾丸注射Zfy干扰载体作为干扰组。采集睾丸、附睾组织,分别制作冰冻切片、固定液中固定及液氮中保存。使用冰冻切片观察载体绿色荧光蛋白在组织中的表达情况。使用免疫组化和HE染色观察干扰组和对照组Zfy蛋白表达情况。通过RT-qPCR检测干扰Zfy基因对睾丸、附睾中精子生成相关基因SYCP3、STRA8、TNP2、FAS表达水平的影响。【结果】绿色荧光蛋白主要在驴曲细精管中的圆形精子细胞和部分长形精子细胞中表达,干扰载体成功转入;干扰组驴睾丸Zfy蛋白表达量显著下调;干扰Zfy基因使驴睾丸中SYC P3基因表达量显著下调、附睾中TNP 2和FAS基因表达量显著下调、而睾丸和附睾中STR A8基因表达量没有明显差异。【结论】驴Zfy基因主要在驴圆形精子中表达,干扰Zfy基因可显著抑制驴睾丸中Zfy蛋白表达、SYC P3基因表达和附睾中TNP 2、FAS基因表达。

驴Zfy基因干扰载体的构建及验证

目的探讨干扰驴Z fy基因的体内外干扰效果。方法根据驴Zfy基因设计合成4段shRNA,并由独立的U6启动子启动,每两个shRNA片段串联组合成干扰载体,体外培养生精细胞检测干扰载体的干扰效率,筛选最佳的干扰载体用于体内验证干扰效果。结果结果显示:构建出2个驴Zfy基因双shRNA串联重组干扰载体CV250-1、CV250-2,细胞水平验证结果表明CV250-1的干扰效率为76.37%±6.36%,差异极显著(P<0.01);CV250-2的干扰效率为67.73%±4.94%,差异显著(P<0.05)。成功对CV250-1重组载体进行体内验证,经母体静脉血胎儿游离DNA性别鉴定得到胎儿雌性率为71.05%(P<0.05)。结论成功构建的驴Zfy基因重组载体CV250-1,可抑制种公驴睾丸组织Zfy基因的表达,细胞水平干扰效率为76.37%,体内试验胎儿雌性率为71.05%,差异显著(P<0.05)。

PCR扩增ZFY、ZFX序列鉴定奶牛性别的灵敏度研究

从克隆、测序所得奶牛ＺＦＹ、ＺＦＸ序列中设计１对高特异性引物（或探针），即分别特异于牛ＺＦＹ、ＺＦＸ的ＺＦ３、ＺＦ４，与克隆时使用的引物ＺＦ２搭配成ＺＦ２、ＺＦ３和ＺＦ２、ＺＦ４。利用这２对引物和ＺＦ１、ＺＦ２对奶牛基因组ＤＮＡ进行ＮｅｓｔＰＣＲ来判断性别，结果达到用超微量（８ｐｇ）ＤＮＡ，即可检出ＺＦＹ、ＺＦＸ序列而判定雌雄的灵敏度；用非同位素标记试剂盒（ＤＩＧ－Ｓｙｓｔｅｍ）标记ＺＦ３、ＺＦ４作为探针，对ＺＦ１、ＺＦ２扩增产物点杂交来判断性别。

辽宁新品系绒山羊ZFX、ZFY基因片段的进化研究与性别鉴定

根据摩弗伦羊(Mouflon)和人(Human)的ZFX、ZFY基因序列以及相关文献设计引物,以雌雄辽宁新品系绒山羊的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增并克隆其ZFX、ZFY基因第11号外显子的部分片段,进行序列测序。结果用NCBI的BLAST,生物软件ClustalX.exe、Mega、BioEdit.exe、DNAClub等进行分析。对辽宁新品系绒山羊(New-breeding cashmere goat)、藏系绵羊(Tibetan sheep)、摩弗伦羊(Mouflon)、马(Horse)、山狗(Coyote)、猪(Pig)、鲸(Whale)、人(Human)和牛(Cow)的ZFX、ZFY基因的外显子同源性进行序列对比分析。用N-J方法构建分子系统树。分析结果表明:ZFX、ZFY基因两者核苷酸同源性达92%,推导的氨基酸同源性为95%。经分析可知,辽宁新品系绒山羊与摩弗伦羊亲缘关系最近,与其他物种的亲缘关系较远。利用限制性内切酶AvaII对辽宁新品系绒山羊ZFX、ZFY基因的PCR产物进行酶切,确定AvaII为ZFX基因上的特异酶切位点,以此对辽宁新品系绒山羊性别进行鉴定。

毛冠鹿ZFY、ZFX基因片段的克隆与性别鉴定

根据人和鼠性别分化相关的ZFY、ZFX基因序列设计引物,以雌雄毛冠鹿的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆到pMD18T上,获得ZFY、ZFX重组克隆,并测定了ZFY、ZFX基因片段的序列,序列比较显示两者同源性达91%,仅在少数位点有差异,以此确定AvaⅡ为ZFX上特异酶切位点,通过PCR扩增和AvaⅡ特异酶切对毛冠鹿性别进行鉴定。

牦牛与其他物种ZFX/ZFY基因片段间的进化关系

利用PCR扩增、克隆和序列分析法对牦牛ZFX/ZFY基因第11外显子部分片段进行了研究,并同来自于NCBIGenBank中人、猩猩、普通牛等9个物种的ZFX/ZFY基因核苷酸及其氨基酸序列进行了进化分析.结果表明,牦牛ZFX、ZFY基因间核苷酸序列同源性为94.1%,显示同一物种同源基因ZFX/ZFY间存在变异;比较的10个物种间ZFX基因核苷酸序列同源性为87.7%、ZFY基因为81.7%,相应ZFX、ZFY氨基酸同源性分别为96.6%、91.0%,ZFY基因的变异性大于ZFX基因,显示X染色体与Y染色体可能是独立进化.

ZFY专门化品系猪主要选育性状典型相关分析

对ZFY专门化品系猪的主要选育性状进行典型相关分析。结果表明:体质量性状、体尺性状、100 kg体质量校正日龄和背膘厚3组性状间均存在较强相关性。体质量与体尺性状间、体质量性状与100 kg体质量校正日龄和背膘厚间的第一典型相关系数均达极显著相关水平(P<0.01),分别为0.828和0.85,占总相关的92.11%和97.80%;体尺性状与100 kg体质量校正日龄和背膘厚间的第一、二典型相关系数达显著相关(P<0.05),第一典型相关系数为0.607,占总相关的78.52%。分析表明,12项选育性状中6月龄体质量、胸围、腹围、100 kg体质量校正日龄和背膘厚起主要作用。

奶牛ZFY、ZFX基因片段的克隆及测序

奶牛的早期胚胎性别鉴定是奶牛胚胎分割及移植技术产生较大经济效益的前提，用ＰＣＲ技术进行早期胚胎性别鉴定具有准确、快速、灵敏度高的特点。利用人和鼠的性别分化相关的ＤＮＡ序列ＺＦＹ、ＺＦＸ基因序列设计的引物对公牛和母牛的染色体ＤＮＡ、ＰＣＲ扩增，将扩增产物定向克隆到ｐＵＣ１１８上，获得ＺＦＹ、ＺＦＸ转化子，并测定了ＺＦＹ、ＺＦＸ基因的序列，发现两者同源性达８８．２％，以此为基础可设计引物和探针，以ＰＣＲ方法进行高灵敏度的奶牛性别鉴定。

奶牛ZFX,ZFY基因片段的克隆、测序及PCR对奶牛性别鉴定灵敏度研究

奶牛胚胎的性别鉴定是多年来奶牛业研究和探索的问题。尤其在体外授精,胚胎分割冷冻,保存及胚胎移植一系列生物科学高技术发展和应用的今天,这一问题的解决显得更加重要和迫切。用分子杂交的方法也可对胚胎进行早期性别鉴定,但这一方法必须要有大量的样品DNA,而且所需时间长。

藏系绵羊ZFX/ZFY基因片段进化分析

目的:获得X染色体、Y染色体在进化上是独立进行的依据。方法:用PCR方法扩增并克隆藏系绵羊ZFX/ZFY基因片段并测序,对ZFX/ZFY基因片段进行了序列比对。结果:扩增的ZFX/ZFY基因片段长度为447bp,该对基因比对结果是总的同源相似率为80.76%,ZFX基因的同源性在96.4～99.3%之间,而ZFY基因的同源性在95.3～98.4%之间;在相应148个氨基酸中,ZFX基因的氨基酸差异为2个,而ZFY基因的氨基酸差异为12个。结论:在进化过程中ZFY基因比ZFX基因更活跃,而ZFX基因较为保守,为研究X染色体、Y染色体在进化上的差异提供参考。

专门化品系ZFY和ZFD的生长性能、胴体及肌肉品质研究

专门化品系ZFY和ZFD都是生长速度较快、饲料报酬较高的专门化新品系,日增重分别为842g和831g,料重比分别为2.58和2.55。屠宰测定表明,ZFY系和ZFD系眼肌面积较大,分别为39.84cm2和39.72cm2,胴体瘦肉率较高,分别为66.15%和69.5%。从肉质分析看,ZFY系的失水率较低,熟肉率、蛋白质和干物质含量较高;ZFD系肌内脂肪含量较高为2.95%,与ZFY系(2.05%)相比差异显著。

逆转录病毒介导的RNAi抑制小鼠生精细胞Zfy基因表达的研究

为了构建逆转录病毒RNAi(RNA interference)载体靶向抑制小鼠生精细胞Zfy基因的表达,检测Zfy基因的沉默效果。将构建好的逆转录病毒RNAi载体转染经分离培养的小鼠生精细胞,筛选出稳定转染的单克隆细胞扩大培养,应用qRT-PCR检测各试验组细胞Zfy基因mRNA的表达情况。结果显示,转染逆转录病毒RNAi载体的生精细胞Zfy基因mRNA的表达水平显著降低,与阴性对照和空白对照相比差异极显著(P<0.01);阴性对照与空白对照之间差异不显著(P>0.05)。因此,逆转录病毒RNAi载体可以稳定、高效抑制Zfy基因的表达,为进一步探究Zfy基因在小鼠生精过程中的作用和功能奠定了基础。

Y染色体ZFY基因检测在组织工程中的应用

目的探讨人的Y染色体ZFY基因诊断在组织工程中的应用。方法对两种人的组织工程皮肤“替代物”进行RT-PCR检测,从mRNA水平检测Y染色体ZFY基因表达。用三条引物同时扩增,Y染色体可产生两个片断,X染色体产生一个片断。结果取男性细胞构建的表皮膜片修复女性皮肤缺损区的少量组织,可以检测到494bp和294bp两个条带;女性则494bp一个条带。检出率达100％(16／16)。用男性包皮角质干细胞构建的复合皮肤修复雌鼠全层皮肤缺损,取植入处少量组织检测到人的Y染色体494bp和294bp两个条带,且维持创面修复时间长达8个月。结论Y染色体ZFY基因诊断可作为组织工程皮肤替代物性别标记,且可以跟踪检测,具有特异、准确之优点。

人类ZFY基因巢式PCR技术的建立及产前诊断的初步研究

目的：建立一种对性连锁遗传病胎儿进行产前性别诊断的方法及探讨利用孕妇外周血中胎儿细胞检测ＺＦＹ基因的可行性。方法：用计算机辅助设计的两对寡核苷酸引物位于染色体ＺＦＹ基因保守区内，并建立了巢式聚合酶链反应（ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）技术扩增男性特异性的ＺＦＹ基因。结果：扩增产物分别为３５４ｂｐ和３０７ｂｐ，对不同标本的扩增结果表明，该引物具有高度的敏感性和特异性，２０份男性标本中均发现特异扩增片段，但在２０份女性标本中均未发现。应用该引物对３１份孕妇外周血连续监测，胎儿ＺＦＹ基因检出率随孕周增加而增高，总准确率达９６８％（３０／３１），４５份绒毛标本的阴性／阳性之比为１：１１４３，接近实际的胎儿性别比。结论：用巢式ＰＣＲ技术检测ＺＦＹ基因具有特异、敏感、快速、准确的优点，提示该法检测胎儿细胞ＤＮＡ是可行的，在临床上可用于性连锁遗传病的产前性别诊断。

ZFX、ZFY基因与动物进化关系的分析

本文对ChinaHolsteinZFY,ZFX基因外显子片段进行克隆、测序,并利用NCBI和BLAST犤5、6、7犦与Japaneseblack、Sheep、Horse、Pig、Human的ZFY、ZFX的同一外显子同源序列进行对比分析,结果表明:本文分析的锌指蛋白基因ZFY和ZFX外显子片段在上述各物种间,种属距离越远,种属间SNP的差异越大。对ChinaHolstein及Japaneseblack间的ZFY、ZFX对比分析表明:同种属内不同品种间的SNP也存在差异,但同源性高于种间。同种属或品种内ZFY与ZFX的同源比较ZFY的SNP高于ZFX,ZFY在进化过程中较ZFX更活跃,而ZFX较为保守,该结果与国外多数学者的研究结果一致犤2、3、13犦,对ZFY与ZFX的SNP性质进行研究发现ZFY中的碱基颠换率为16.22%、ZFX为16%.本文结果可作为奶牛胚胎早期性别鉴定的基础方法。

性别鉴定的分子生物学技术与ZFY途径

立足性别决定的雄性决定说，综述了三十年来搜寻Ｙ染色体上睾丸决定因子（ＴＤＦ）的进程以及在此理论基础上发展起来的Ｙ－特异ＤＮＡ探针杂交、ＰＣＲ扩增Ｙ－特异ＤＮＡ、ＰＣＲ扩增ＳＲＹ序列、ＰＣＲ扩增ＺＦＹ序列等分子水平性别鉴定技术；

扩增ZFX/ZFY基因—一个可靠的性别鉴定系统

应用PCR技术扩增人ZFX和ZFY基因特异性DNA顺序,在男性DNA中检测到ZFX基因特异和ZFY基因特异的两种扩增产物,在女性DNA中仅检测到ZFX基因特异的一种扩增产物。采用ZFX/ZFY扩增系统进行性别鉴定的优点为:①检测X、Y两条性染色体,无假阴性结果;②ZFY基因位于Y染色体短臂,不受Y染色体长臂正常变异影响;③ZFY基因邻接TDF基因,适于性反转受检者;④扩增产物可经电泳直接区分。

ZFY基因与性征异常疾病相关性研究

一组性征异常病人DNA经Eec RI酶切后,用^(32)P标记的ZFY探针进行Southern印迹杂交。结果发现:3例47,XXY Klinefelter综合症及1例45,XO Turner’s综合症有杂交信号,并首次发现了1例46,XX真两性畸形病人存在着Y特异性的DNA序列ZFY。提示,ZFY基因在性别决定过程中可能起某些作用或可能与性征发育异常有一定相关性。

应用SRY基因、ZFX/ZFY基因和DYZ1顺序检测性发育异常

目的 :从基因水平进行性别检测 ,为性发育异常患者的基因结构分析提供依据和检测方法。方法 :应用PCR技术 ,扩增SRY基因、ZFX/ZFY基因、DYZ1顺序进行性发育异常患者的基因检测。结果 :检测 14例患者中 ,1～ 4例为SRY基因异常所致的性反转综合征 ;5～ 7例为性染色体数目异常或结构畸变所致的Turner综合征 ;8～ 9例为性染色体 (X)与常染色体易位所致性腺发育不全 ;10～ 14例为Y染色体多态。结论 :SRY基因和性染色体数目异常及结构畸变是导致性发育异常的主要原因 。