干扰牛Zfy基因的载体构建及其在细胞水平上的效果验证

重组载体可以靶向干扰公牛睾丸中Zfy基因的表达,从而影响Y精子的发育和形成过程,引起睾丸中X、Y精子的比例发生偏移。本试验用pLL3.7质粒重组构建3个牛Zfy基因mRNA干扰载体,即pLL3.7/a、pLL3.7/b、pLL3.7/c。同时设置空白对照(等体积生理盐水)、空载体(无干扰片段)等作为对照组,建立生殖细胞系的体外培养体系,用脂质体2000将质粒载体转染到生精细胞,运用RT-qPCR、免疫印迹(Western Blot,WB)方法从细胞水平上筛选出效果最佳的干扰载体。结果表明,同对照组相比,pLL3.7/a能使Zfy基因mRNA表达水平下降68.65%±7.25%(P<0.01);pLL3.7/c能使Zfy基因mRNA表达水平下降23.36%±3.67%(P<0.05);pLL3.7/b能使Zfy基因mRNA表达水平下降11.01%±2.14%(P>0.05)。WB试验与RT-qPCR检测结果一致,因此,pLL3.7/a干扰效果最佳。本研究结果将为从基因层面实现性别控制技术的研发和奶牛养殖业的发展提供技术支撑。

体内干扰Zfy基因对驴精子发育相关基因表达的影响

【目的】研究体内干扰Zfy基因对驴睾丸、附睾组织中Zfy蛋白表达以及精子发育相关基因表达的影响。【方法】选取健康种公驴,将一侧睾丸注射空载体作为对照组,另一侧睾丸注射Zfy干扰载体作为干扰组。采集睾丸、附睾组织,分别制作冰冻切片、固定液中固定及液氮中保存。使用冰冻切片观察载体绿色荧光蛋白在组织中的表达情况。使用免疫组化和HE染色观察干扰组和对照组Zfy蛋白表达情况。通过RT-qPCR检测干扰Zfy基因对睾丸、附睾中精子生成相关基因SYCP3、STRA8、TNP2、FAS表达水平的影响。【结果】绿色荧光蛋白主要在驴曲细精管中的圆形精子细胞和部分长形精子细胞中表达,干扰载体成功转入;干扰组驴睾丸Zfy蛋白表达量显著下调;干扰Zfy基因使驴睾丸中SYC P3基因表达量显著下调、附睾中TNP 2和FAS基因表达量显著下调、而睾丸和附睾中STR A8基因表达量没有明显差异。【结论】驴Zfy基因主要在驴圆形精子中表达,干扰Zfy基因可显著抑制驴睾丸中Zfy蛋白表达、SYC P3基因表达和附睾中TNP 2、FAS基因表达。

睾丸注射Zfy基因RNA干扰质粒对湖羊精液品质的影响

为了研究锌指蛋白(Zfy)基因RNA干扰质粒对湖羊精液品质的影响,试验选取6只周岁湖羊种公羊,随机分为试验组和对照组,每组3只,试验组施行睾丸注射湖羊Zfy基因重组干扰质粒CV250-1,对照组不注射;采集两组公羊精液并制作冻精,鉴定原精和冻精品质。结果表明:两组的新鲜精液状态均为云雾状,乳白色,无明显腥味;与对照组相比,试验组原精的采精量、pH值、精子密度变化不显著(P>0.05),但冻精的精子活力极显著降低(P<0.01),精子畸形率、精子质膜不完整率、精子顶体不完整率均极显著升高(P<0.01),细菌含量显著升高(P<0.05)。说明湖羊Zfy基因重组干扰质粒CV250-1有效沉默了Zfy基因,对Y精子发育产生了影响,导致正常的Y精子数量减少,精子运动及受精能力受损。

牦牛与其他物种ZFX/ZFY基因片段间的进化关系

利用PCR扩增、克隆和序列分析法对牦牛ZFX/ZFY基因第11外显子部分片段进行了研究,并同来自于NCBIGenBank中人、猩猩、普通牛等9个物种的ZFX/ZFY基因核苷酸及其氨基酸序列进行了进化分析.结果表明,牦牛ZFX、ZFY基因间核苷酸序列同源性为94.1%,显示同一物种同源基因ZFX/ZFY间存在变异;比较的10个物种间ZFX基因核苷酸序列同源性为87.7%、ZFY基因为81.7%,相应ZFX、ZFY氨基酸同源性分别为96.6%、91.0%,ZFY基因的变异性大于ZFX基因,显示X染色体与Y染色体可能是独立进化.

藏系绵羊ZFX/ZFY基因片段进化分析

目的:获得X染色体、Y染色体在进化上是独立进行的依据。方法:用PCR方法扩增并克隆藏系绵羊ZFX/ZFY基因片段并测序,对ZFX/ZFY基因片段进行了序列比对。结果:扩增的ZFX/ZFY基因片段长度为447bp,该对基因比对结果是总的同源相似率为80.76%,ZFX基因的同源性在96.4～99.3%之间,而ZFY基因的同源性在95.3～98.4%之间;在相应148个氨基酸中,ZFX基因的氨基酸差异为2个,而ZFY基因的氨基酸差异为12个。结论:在进化过程中ZFY基因比ZFX基因更活跃,而ZFX基因较为保守,为研究X染色体、Y染色体在进化上的差异提供参考。

逆转录病毒介导的RNAi抑制小鼠生精细胞Zfy基因表达的研究

为了构建逆转录病毒RNAi(RNA interference)载体靶向抑制小鼠生精细胞Zfy基因的表达,检测Zfy基因的沉默效果。将构建好的逆转录病毒RNAi载体转染经分离培养的小鼠生精细胞,筛选出稳定转染的单克隆细胞扩大培养,应用qRT-PCR检测各试验组细胞Zfy基因mRNA的表达情况。结果显示,转染逆转录病毒RNAi载体的生精细胞Zfy基因mRNA的表达水平显著降低,与阴性对照和空白对照相比差异极显著(P<0.01);阴性对照与空白对照之间差异不显著(P>0.05)。因此,逆转录病毒RNAi载体可以稳定、高效抑制Zfy基因的表达,为进一步探究Zfy基因在小鼠生精过程中的作用和功能奠定了基础。

人类ZFY基因巢式PCR技术的建立及产前诊断的初步研究

目的：建立一种对性连锁遗传病胎儿进行产前性别诊断的方法及探讨利用孕妇外周血中胎儿细胞检测ＺＦＹ基因的可行性。方法：用计算机辅助设计的两对寡核苷酸引物位于染色体ＺＦＹ基因保守区内，并建立了巢式聚合酶链反应（ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）技术扩增男性特异性的ＺＦＹ基因。结果：扩增产物分别为３５４ｂｐ和３０７ｂｐ，对不同标本的扩增结果表明，该引物具有高度的敏感性和特异性，２０份男性标本中均发现特异扩增片段，但在２０份女性标本中均未发现。应用该引物对３１份孕妇外周血连续监测，胎儿ＺＦＹ基因检出率随孕周增加而增高，总准确率达９６８％（３０／３１），４５份绒毛标本的阴性／阳性之比为１：１１４３，接近实际的胎儿性别比。结论：用巢式ＰＣＲ技术检测ＺＦＹ基因具有特异、敏感、快速、准确的优点，提示该法检测胎儿细胞ＤＮＡ是可行的，在临床上可用于性连锁遗传病的产前性别诊断。

Y染色体ZFY基因检测在组织工程中的应用

目的探讨人的Y染色体ZFY基因诊断在组织工程中的应用。方法对两种人的组织工程皮肤“替代物”进行RT-PCR检测,从mRNA水平检测Y染色体ZFY基因表达。用三条引物同时扩增,Y染色体可产生两个片断,X染色体产生一个片断。结果取男性细胞构建的表皮膜片修复女性皮肤缺损区的少量组织,可以检测到494bp和294bp两个条带;女性则494bp一个条带。检出率达100％(16／16)。用男性包皮角质干细胞构建的复合皮肤修复雌鼠全层皮肤缺损,取植入处少量组织检测到人的Y染色体494bp和294bp两个条带,且维持创面修复时间长达8个月。结论Y染色体ZFY基因诊断可作为组织工程皮肤替代物性别标记,且可以跟踪检测,具有特异、准确之优点。

ZFX、ZFY基因与动物进化关系的分析

本文对ChinaHolsteinZFY,ZFX基因外显子片段进行克隆、测序,并利用NCBI和BLAST犤5、6、7犦与Japaneseblack、Sheep、Horse、Pig、Human的ZFY、ZFX的同一外显子同源序列进行对比分析,结果表明:本文分析的锌指蛋白基因ZFY和ZFX外显子片段在上述各物种间,种属距离越远,种属间SNP的差异越大。对ChinaHolstein及Japaneseblack间的ZFY、ZFX对比分析表明:同种属内不同品种间的SNP也存在差异,但同源性高于种间。同种属或品种内ZFY与ZFX的同源比较ZFY的SNP高于ZFX,ZFY在进化过程中较ZFX更活跃,而ZFX较为保守,该结果与国外多数学者的研究结果一致犤2、3、13犦,对ZFY与ZFX的SNP性质进行研究发现ZFY中的碱基颠换率为16.22%、ZFX为16%.本文结果可作为奶牛胚胎早期性别鉴定的基础方法。

扩增ZFX/ZFY基因—一个可靠的性别鉴定系统

应用PCR技术扩增人ZFX和ZFY基因特异性DNA顺序,在男性DNA中检测到ZFX基因特异和ZFY基因特异的两种扩增产物,在女性DNA中仅检测到ZFX基因特异的一种扩增产物。采用ZFX/ZFY扩增系统进行性别鉴定的优点为:①检测X、Y两条性染色体,无假阴性结果;②ZFY基因位于Y染色体短臂,不受Y染色体长臂正常变异影响;③ZFY基因邻接TDF基因,适于性反转受检者;④扩增产物可经电泳直接区分。

ZFY基因与性征异常疾病相关性研究

一组性征异常病人DNA经Eec RI酶切后,用^(32)P标记的ZFY探针进行Southern印迹杂交。结果发现:3例47,XXY Klinefelter综合症及1例45,XO Turner’s综合症有杂交信号,并首次发现了1例46,XX真两性畸形病人存在着Y特异性的DNA序列ZFY。提示,ZFY基因在性别决定过程中可能起某些作用或可能与性征发育异常有一定相关性。

应用SRY基因、ZFX/ZFY基因和DYZ1顺序检测性发育异常

目的 :从基因水平进行性别检测 ,为性发育异常患者的基因结构分析提供依据和检测方法。方法 :应用PCR技术 ,扩增SRY基因、ZFX/ZFY基因、DYZ1顺序进行性发育异常患者的基因检测。结果 :检测 14例患者中 ,1～ 4例为SRY基因异常所致的性反转综合征 ;5～ 7例为性染色体数目异常或结构畸变所致的Turner综合征 ;8～ 9例为性染色体 (X)与常染色体易位所致性腺发育不全 ;10～ 14例为Y染色体多态。结论 :SRY基因和性染色体数目异常及结构畸变是导致性发育异常的主要原因 。

人类ZFY基因自动测序及影响因素的探讨

目的 建立一种较简便、敏感的对性连锁遗传病胎儿进行产前性别鉴定方法并探讨高温循环全自动测序中几个因素对测序鉴定ZFY基因结果的影响。方法 自行设计ZFY引物并建立了巢式聚合酶链反应扩增男性特异性ZFY基因方法 ,计算机辅助设计的两对寡核苷酸引物位于Y染色体短臂的Ucdo4 3保守区内 ;同时对DNA纯度、浓度和测序过程中水的质量对DNA自动测序结果的影响进行回顾性分析。结果 结果表明在DNA纯度、浓度较低以及配制测序胶时所用纯水水质较差时 ,对测序曲线造成不同程度的影响 ,从而影响测序结果。结论 提示该方法检测胎儿DNA是可行的 ,同时在DNA自动测序鉴定产物特异性时需使用高纯度高浓度的DNA和高质量的纯水 ,要想获得较长的测序片段 ,所用模板浓度不能太低。

驴Zfy基因cDNA克隆及生物信息学分析

本研究旨在对驴Zfy基因的cDNA序列进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中公布的家牛Zfy基因mRNA序列(登录号:NM_177491.1)设计特异性引物,运用RT-PCR技术获取驴Zfy基因的cDNA序列,并对Zfy基因CDS区核苷酸序列与蛋白质结构进行生物信息学分析。结果表明,驴Zfy基因CDS区序列长度为2 325bp,编码774个氨基酸;蛋白质二级结构预测结果显示,Zfy蛋白没有信号肽及跨膜结构;驴Zfy基因CDS区序列与家牛、绵羊、人、家猫、家犬、马鹿、黑猩猩、藏羚羊的同源性分别为92.9%、92.6%、91.8%、93.8%、92.5%、92.3%、91.6%和92.6%;对驴和其他8种哺乳动物Zfy基因CDS区核苷酸序列构建的系统进化树显示,驴与绵羊、藏羚羊、家牛、马鹿亲缘关系较近,与家犬和家猫的亲缘关系稍远,与人和黑猩猩亲缘关系最远。本研究成功克隆出驴Zfy基因CDS区序列,为进一步研究驴Zfy基因的功能奠定了基础。

siRNA介导小鼠Zfy基因干扰的定量分析

为了研究Zfy基因在生精过程中的作用,采用RNA干涉的方法抑制Zfy基因的表达,设计并构建Zfy基因的siRNA重组表达载体(pSilencer5.1/Zfy225及pSilencer5.1/Zfy2122)。选取32只雄鼠随机分成4组,其中2组分别注射本研究构建的2个重组表达载体作为试验组,另2组分别注射相同体积空载体和生理盐水作为对照组,采用睾丸局部注射的方式导入雄鼠体内,间隔10d注射1次,共4次,最后1次注射17d后,采集睾丸组织,利用荧光实时定量PCR法检测Zfy基因mRNA的表达水平。结果表明,pSilencer5.1/Zfy2122干扰后Zfy基因的mR-NA表达水平显著降低,与对照组比较差异极显著(P<0.01);pSilencer5.1/Zfy225差异显著(P<0.05)。其结果可为研究Zfy基因在小鼠生精过程中的功能奠定基础。

马鹿Zfx/Zfy基因的克隆及序列分析

根据GenBank中公布的牛Zfx/Zfy基因的mRNA序列,设计特异性引物,对马鹿Zfx/Zfy基因进行扩增,并对该序列进行分析。结果表明,克隆得到马鹿Zfx基因序列长为2 115bp,GenBank登录号为KP257294.1,编码696个氨基酸;Zfy基因序列长为2 406bp,GenBank登录号为KU041539,编码801个氨基酸。依据Zfx/Zfy基因氨基酸序列构建进化树,分析表明,马鹿Zfx基因与人的亲缘关系较近,与聚为一类的野牛、藏羚羊、虎、家猫、家牛、家犬、绵羊的亲缘关系稍远;Zfy基因与家牛、野牛、藏羚羊、绵羊的亲缘关系较近,与其他动物及人的亲缘关系较远。本研究首次克隆了马鹿Zfx/Zfy基因,为研究该基因蛋白质的结构和功能奠定了基础。

山羊Zfy基因克隆分析及其敲除载体构建

旨在对西农萨能奶山羊Zfy基因进行克隆和生物信息学分析,并利用CRISPR/Cas9技术成功获得敲除Zfy基因的奶山羊成纤维细胞株,为进一步探索Zfy基因功能及性别调控提供基础数据。本研究以健康的西农萨能奶山羊为对象,采集3只3月龄公山羊睾丸组织并提取总RNA。根据NCBI中预测的山羊Zfy基因mRNA序列信息(GenBank登录号:XM_018044893)设计引物,利用RT-PCR技术分段克隆获得山羊Zfy基因序列,使用相关生物信息学软件分析Zfy基因CDS区核苷酸序列并预测其蛋白质的结构和功能。针对山羊Zfy基因CDS区共设计了4条sgRNA,构建4个打靶载体并转染山羊胎儿成纤维细胞(GFFs),利用T7E1酶切检验打靶载体的切割效率,通过嘌呤霉素筛选敲除Zfy基因的GFFs阳性单克隆细胞,经PCR扩增、测序检测突变率。结果显示,成功克隆得到了长度为2406 bp的西农萨能奶山羊Zfy基因CDS区序列。同源性以及系统进化树分析表明,山羊Zfy基因序列与马鹿、牛、绵羊的同源性高,亲缘关系较近,与小鼠的同源性最低,亲缘关系最远。生物信息学软件分析显示,山羊Zfy基因共编码801个氨基酸,分子质量为90.37 ku,Zfy蛋白含66个磷酸化位点,等电点为5.66,亲水性较高,无信号肽,是一个结构不稳定的非分泌蛋白。T7E1酶切发现,4个打靶载体均可发挥敲除活性,切割效率分别为12.31%、40.86%、31.52%、26.37%。选择切割效率最高的打靶质粒转染山羊胎儿成纤维细胞(GFFs),经嘌呤霉素筛选获得能稳定靶向敲除Zfy基因的GFFs阳性细胞株,PCR测序检测突变率为23.91%。综上所述,本研究成功克隆了西农萨能奶山羊Zfy基因并揭示了该基因所编码蛋白的理化性质;成功构建了山羊Zfy基因CRISPR/Cas9敲除载体,并筛选出最佳敲除位点,获得了Zfy基因敲除的亚克隆细胞,为深入研究山羊Zfy基因功能及开发性别控制技术奠定了基础。

绵羊Zfy基因干扰载体构建及性控效果观察

为了研究绵羊Zfy基因干扰载体对性控效果的影响,本试验利用RNA干扰技术针对绵羊Zfy基因m RNA序列设计、构建3个sh RNA干扰载体(p LL3.7-A、p LL3.7-B和p LL3.7-C),并对体外培养的生精细胞进行转染,利用q RT-PCR测定Zfy基因m RNA表达丰度,从而筛选出有效的干扰载体。然后将效果较好的干扰载体通过绵羊睾丸注射,进行体内干扰试验。q RT-PCR检测结果显示:成功构建了3个干扰载体,其中p LL3.7-A、p LL3.7-B对生精细胞Zfy基因的表达水平分别下降了54%(P<0.05)、26%(P<0.05),而p LL3.7-C对其干扰效果不明显(P>0.05);p LL3.7-A、p LL3.7-B干扰载体的体内干扰试验结果显示,后代雌羔率分别为64.7%(P<0.01)、44.4%(P>0.05)。本研究结果表明,本实验构建的干扰载体对绵羊Zfy基因产生干扰作用,且使后代性别比例发生一定程度的偏移,为进一步研究绵羊性别控制提供了理论依据。

驴Zfy基因干扰载体的构建及验证

目的探讨干扰驴Z fy基因的体内外干扰效果。方法根据驴Zfy基因设计合成4段shRNA,并由独立的U6启动子启动,每两个shRNA片段串联组合成干扰载体,体外培养生精细胞检测干扰载体的干扰效率,筛选最佳的干扰载体用于体内验证干扰效果。结果结果显示:构建出2个驴Zfy基因双shRNA串联重组干扰载体CV250-1、CV250-2,细胞水平验证结果表明CV250-1的干扰效率为76.37%±6.36%,差异极显著(P<0.01);CV250-2的干扰效率为67.73%±4.94%,差异显著(P<0.05)。成功对CV250-1重组载体进行体内验证,经母体静脉血胎儿游离DNA性别鉴定得到胎儿雌性率为71.05%(P<0.05)。结论成功构建的驴Zfy基因重组载体CV250-1,可抑制种公驴睾丸组织Zfy基因的表达,细胞水平干扰效率为76.37%,体内试验胎儿雌性率为71.05%,差异显著(P<0.05)。

三江黄牛Y染色体ZFY基因遗传多样性研究

三江黄牛原产于四川省阿坝藏族羌族自治州汶川县,具有躯干较长、役用性能良好、适应性强、肉质好等特点,是经长期人工选育的优良地方黄牛品种,为遗传资源宝贵基因库。试验对三江黄牛Y染色体特异ZFY基因作遗传多态性分析,发掘三江黄牛遗传起源。结果表明,ZFY基因第11外显子长度为1 090 bp,T、A、C、G平均含量分别为24.2%、34.2%、20.7%、20.9%,存在碱基偏好性;发现22个突变位点,18个转换,4个颠换,其核苷酸多样性(Pi)为0.007 61,检出16种单倍型,单倍型多样性(Hd)为0.993,说明三江黄牛群体ZFY基因遗传多样性较丰富;系统进化和遗传距离分析表明,三江黄牛优先和大额牛、瘤牛、野牛聚为一类,研究为濒危三江黄牛品种保种、选育及来源提供依据。