茉莉酸信号转录抑制关键组分JAZ与NINJA互作体系建立及复合体结晶条件筛选

[目的]本文旨在建立JAZ与NINJA蛋白离体和活体互作以及2个蛋白复合体晶体筛选的体系,并获得2个蛋白复合体晶体。[方法]采用酵母双杂交和双分子荧光互补法用于活体条件下JAZ与NINJA蛋白互作区域的验证;在离体条件下,通过氢氘交换质谱(HDX)和Alpha Screen验证JAZ与NINJA蛋白的互作区域并进一步筛选2个蛋白互作的最小区域;使用原核(大肠杆菌)表达系统、亲和层析和凝胶过滤层析纯化等手段获得NINJA截短蛋白。将NINJA截短蛋白与JAZ多肽按照物质的量比为1∶1.5混合孵育一段时间,通过坐滴结晶方法进行复合体结晶,最终获得复合体晶体。[结果]成功创建了JAZ与NINJA离体和活体互作体系;获得JAZ多肽与NINJA(342~406)的复合体晶体的条件分别是0.2 mol·L^(-1) CaCl_(2)·2H_(2)O、0.1 mol·L^(-1) BIS-Tris(pH6.5)、45%2-甲基-2,4-戊二醇与0.2 mol·L^(-1)醋酸铵、0.1 mol·L^(-1) Tris(pH8.5)、45%2-甲基-2,4-戊二醇。[结论]JAZ蛋白ZIM结构域的TIFY基序和羧基端与NINJA(342~406)是JAZ与NINJA蛋白互作所必需的;JAZ蛋白ZIM结构域是JAZ同源和异源互作所必需的;成功获得了JAZ与NINJA复合体晶体。