真核表达载体pEGFP-N1-kin17的构建及其在Zmpste24^(-/-)小鼠胚胎成纤维细胞内的表达

目的构建人kin17基因真核表达载体pEGFP-N1-kin17,将载体转染至野生型及Zmpste24基因缺失的小鼠胚胎成纤维上皮细胞,荧光显微镜观察kin17蛋白表达情况。方法用高保真DNA聚合酶,从pCMV-kin17载体中扩增获取人kin17 cDNA编码序列,将其克隆至pEGFP-N1载体中,经酶切、连接、转化后,挑取阳性克隆进行菌液进行PCR、菌液质粒双酶切及测序鉴定;将成功构建的GFP-kin17表达载体转染Zmpste24-/-MEFs,荧光显微镜观察kin17蛋白的核定位情况。结果 pEGFP-N1-kin17转化细菌克隆测序结果完全正确;将载体转入MEFs后,可以通过荧光显微镜观察到kin17蛋白的表达。结论成功构建GFP融合的kin17真核表达载体,该载体为kin17蛋白的研究提供工具。本实验中载体pEGFP-N1-kin17在野生型和Zmpste24-/-MEFs中均成功表达。

Zmpste24基因缺失与早老症

衰老是一种生理完整性丧失,功能受损,疾病和死亡风险增加的过程。早老症(HGPS)是一种加速化的衰老疾病,是研究人类正常衰老理想的疾病模型。由LMNA基因突变产生prelamin AΔ50在细胞内累积是造成早老症的主要原因,早老症病人表现出寿命急剧缩短,老化特征明显的现象,例如脱发、皮下脂肪减少、骨质疏松以及早逝。锌金属蛋白酶Zmpste24是prelamin A加工成为成熟lamin A蛋白的关键酶。敲除Zmpste24基因的小鼠表现出与早老症高度一致的衰老表型,同时也存在非常相似的发病机制,如染色质异常、DNA损伤和干细胞功能缺失等。Zmpste24缺失小鼠作为典型的早老模型小鼠因其衰老周期短,衰老特征明显而获得广泛应用。本文总结了以Zmpste24缺失早老小鼠为模型取得的早老相关分子机制的研究进展,以及抗衰老策略的最新发现。

一例ZMPSTE24基因复合杂合突变导致颅骨下颌骨皮肤发育不全B型的诊断和基因检测分析

颅骨下颌骨皮肤发育不全(mandibuloacral dysplasia,MAD)是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病,主要与LMNA及ZMPSTE24基因发生变异有关。本文报道了国内首例颅骨下颌骨皮肤发育不全B型患者,主要表现为特殊面容、喂养困难、体格生长明显落后、全面的发育迟缓伴牙齿和骨骼发育异常。全外显子组家系测序结果显示患者携带ZMPSTE24基因c.743C>T(p.Pro248Leu)(dbSNP:rs121908095)与1~10号外显子缺失的复合杂合突变,经Sanger测序与定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)实验检测显示,两个突变分别遗传自其表型正常的母亲与父亲。通过总结分析该例病例特点及其家系遗传规律,对于临床上难以进行明确诊断的疾病,建议进行全外显子组家系测序,辅助疾病的诊断。该病例的发现提高了临床医师对MAD疾病的认识,也为该疾病后续的遗传学研究提供新的临床资料。

ZMPSTE24表达水平与原发性胶质瘤的关系:一项基于CGGA数据库的研究

目的探讨ZMPSTE24表达水平与原发性胶质瘤的关系。方法从中国脑胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)下载325例胶质瘤患者的临床数据和mRNA测序数据。提取ZMPSTE24基因表达量并与临床数据配对合并,同时剔除相关临床数据缺失的病例。依据ZMPSTE24基因在原发性胶质瘤患者(n=210)组织中表达量的中位值(18.61)将入选病例分为高表达组(105例)和低表达组(105例)。采用Wilcoxon符号秩检验和Logistic回归分析ZMPSTE24表达水平与各临床因素的相关性。使用Cox回归和Kaplan-Meier方法评估ZMPSTE24表达水平与胶质瘤患者总生存期的影响。通过基因富集和共表达分析,推测ZMPSTE24可能参与的分子通路和上下游分子。用STRING数据库,寻找与ZMPSTE24存在相互作用的分子并评价其价值。利用TIMER2.0数据库探究ZMPSTE24表达水平与胶质瘤免疫浸润细胞之间的相关性。最后利用人类蛋白图谱数据库(HPA)和临床胶质瘤病理组织行免疫组织化学和蛋白免疫印迹实验进行验证。结果在CGGA数据库中,原发性胶质瘤患者ZMPSTE24高表达组的总生存率显著低于低表达组(P<0.001),并与WHO分级、IDH分型、年龄等相关(P<0.001)。Cox回归分析显示,ZMPSTE24可能是胶质瘤患者的独立预后因素(P<0.001)。蛋白印迹实验提示,肿瘤分级级别越高,ZMPSTE24的表达水平相对越高。结论ZMPSTE24表达水平越高,提示胶质瘤肿瘤分级较高,预后较差。

PML2过表达促进Zmpste24^-/-早衰小鼠胚胎成纤维细胞衰老

该研究以Zmpste24基因缺陷早衰小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为模型,探索细胞核内亚结构PML NBs(promyelocytic leukemia nuclear bodies)与细胞衰老之间的关联。在Zmpste24野生型(+/+)和缺陷型(-/-)MEF细胞中过表达GFP-PML1和GFP-PML2及对照GFP,通过传代计数监测细胞增殖,β-gal染色检测细胞衰老,免疫荧光观察PML NBs结构形态、增殖标志物Ki-67和DNA损伤应答信号γH2AX。结果显示,过表达PML2而非PML1显著抑制Zmpste24+/+和Zmpste24-/-MEF细胞的增殖,降低Ki-67阳性细胞比例,削弱DNA损伤修复能力,加速细胞衰老。而且,过表达PML2促进Zmpste24-/-MEF细胞衰老的效应比在Zmpste24+/+细胞中更为显著。此外,对比Zmpste24+/+,在Zmpste24-/-MEF细胞中过表达PML2可诱导更高比例的细胞产生线性PML NBs结构,且实验证明这种异常结构与细胞衰老紧密关联。

ZMPSTE24基因杂合变异致不典型下颌骨发育不良伴B型脂肪代谢障碍1例

目的 报道1例ZMPSTE24基因复合杂合变异c.743C>T(p.P248L)/loss1(EXON:1-10)(all)导致的下颌骨发育不良伴B型脂肪代谢障碍(MADB,OMIM#608612)病例,总结临床特征及基因突变的特点,为进一步了解MADB提供参考。方法 对1例ZMPSTE24基因复合杂合变异的不典型MADB患儿的临床资料和测序结果进行分析,结合人类基因突变数据库和PubMed,对ZMPSTE24基因突变所致疾病临床表型进行文献复习。结果 1例患儿具有MADB临床表型,外周血染色体及基因测序检测到ZMPSTE24基因复合杂合变异(c.743C>T (p.P248L)/loss1(EXON:1-10)(all)),查询MAF数据库、gnomAD数据库和千人基因组数据库,目前未见该变异类型。结论 本例检测到的ZMPSTE24基因复合杂合变异与MADB高度相关。本研究提示ZMPSTE24基因存在多种变异形式,可导致多种形式的临床表型,基因检测可明确诊断。早期基因诊断可为临床及时干预和遗传咨询提供依据。

ZM PSTE24基因突变致限制性皮病1例病例报告并文献复习

目的报告1例ZMPSTE24基因突变致胎儿死亡的限制性皮病(RD)病例,总结临床特征及基因突变的特点,为产前咨询提供依据。方法对1例ZMPSTE24基因突变的RD患儿的临床资料和测序结果进行分析,结合人类基因突变数据库(HGMD)和PubMed,对ZMPSTE24基因突变所致疾病临床表型进行文献复习。结果男,死胎,G1P1。母亲孕27周行超声检查,胎儿臀位、羊水过少、羊水指数1.9 cm、胎儿右侧胸腔少量积液。孕31+3周因胎膜早破入院,伴妊娠期糖尿病,超声示胎儿宫内重度生长受限。孕32+2周娩出一男死胎,具有典型RD表型。为明确病因诊断行新生儿panel测序并行Sanger测序验证,检测到ZMPSTE24基因的一个纯合移码突变(c.1085dupT,p.Leu362PhefsTer19),为已报道的RD热点突变,突变频率达57.14%。检索HGMD和PubMed,共检索到ZMPSTE24基因的32种致病突变(63例),导致4种不同的疾病表型。检索万方、中国知网和PubMed数据库,检索时间从建库至2019年7月25日,共有49例(包括本文1例)ZMPSTE24突变导致RD。ZMPSTE24突变的临床表型严重程度与锌金属蛋白酶活性和核纤层蛋白前体蛋白的堆积程度相关。结论本例检测到的Leu362PhefsTer19突变为ZMPSTE24基因热点突变,ZMPSTE24基因型与临床表型呈高度相关。本研究提示妊娠期胎儿发育异常应注意RD可能,基因检测可明确诊断。早期基因诊断可为临床及时干预和遗传咨询提供依据。

核层蛋白A前体的法尼基化与衰老

编码核层蛋白A(lamin A)的LMNA基因突变导致法尼基化的核层蛋白A前体(prelamin A)不能被进一步加工成成熟的核层蛋白A,从而导致一种Hutchinson-Gilford早老症综合征(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)。一种更严重的早老症——限制性皮肤病(restrictive dermopathy,RD),是由于缺失核层蛋白A前体加工过程中的剪切酶ZMPSTE24引起的。ZMPSTE24的缺失阻止了法尼基化的核层蛋白A前体不能正常加工成为成熟的核层蛋白A,同时导致法尼基化的核层蛋白A前体的堆积。在HGPS和RD病人的成纤维细胞中,发现法尼基化的核层蛋白A前体都定位在核膜,从而影响细胞核膜的完整性,并导致细胞核形的异常,进而导致衰老。最近研究表明经过法尼基酰转移酶抑制剂(farnesyltransferase inhibitor,FTI)处理后的细胞的核形异常减少。同时,FTI能够改善HGPS和RD小鼠的早老症状。本文就核层蛋白A前体的法尼基化对衰老的影响有关研究进展作一综述。