miR-362靶向ZNF644基因调控猪未成熟支持细胞的增殖和凋亡

睾丸组织中未成熟支持细胞的增殖能力决定成熟支持细胞的数量,进而制约成年雄性动物的精子生成能力。研究表明microRNA(miRNA)参与调控猪未成熟支持细胞的增殖和凋亡,但大部分鉴定出的miRNA功能仍不明确。本文基于前期RNA-seq数据筛选结果,研究了miR-362对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的调控作用。首先利用生物信息学方法预测miR-362的靶基因,通过qRT-PCR技术检测miR-362和ZNF644基因在不同发育阶段的猪睾丸组织中的表达水平以及在猪未成熟支持细胞中过表达或抑制表达miR-362后ZNF644基因的表达水平,采用双荧光素酶报告基因系统验证miR-362与ZNF644基因之间的靶向关系。结果显示,miR-362与ZNF644基因3′UTR具有一个潜在的结合位点,miR-362和ZNF644基因在猪睾丸组织中的mRNA表达水平显著负相关(r=-0.723,P<0.01),miR-362和psi CHECK2-ZNF644-WT 3′UTR共转染组的双荧光活性显著降低,且miR-362显著调节ZNF644基因的表达水平,表明miR-362靶向ZNF644基因并抑制其表达水平。为进一步检测过表达miR-362或抑制表达ZNF644基因对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的影响,通过流式细胞术检测细胞周期,CCK8和EdU试剂盒检测细胞增殖情况,Annexin V-FITC/PI方法和qRT-PCR技术检测细胞凋亡情况及凋亡相关基因的表达水平。结果表明,过表达miR-362后,猪未成熟支持细胞周期被阻滞在G_1期,抑制表达ZNF644基因后,猪未成熟支持细胞被阻滞在G2期,细胞增殖能力显著减弱,细胞凋亡率显著提高,细胞凋亡相关基因呈促进凋亡的差异表达。本研究结果证实miR-362靶向ZNF644基因抑制猪未成熟支持细胞的增殖而促进其凋亡,为深入研究miR-362在猪精子生成过程中的生物学功能提供了理论基础。

高度近视家系ZNF644基因突变筛查

目的明确10个高度近视家系是否与ZNF644基因突变有关。方法收集符合常染色体显性遗传的10个高度近视家系,对同意参加本研究的99例成员进行详细的临床检查,提取所有成员外周血白细胞DNA,采用PCR方法,对家系先证者ZNF644基因的外显子各片段进行扩增,并对PCR产物进行正、反双向测序。结果 10个高度近视家系先证者ZNF644基因测序发现3个已知单核苷酸多态性,分别为rs358691、rs17131232和rs76101054,未发现ZNF644基因突变。结论高度近视存在遗传异质性,遗传性高度近视发病可能只部分与ZNF644基因突变相关。

中国汉族高度近视一家系的ZNF644基因突变分析

目的:ZNF644基因突变被报道与一个中国汉族(四川)高度近视家系的性状相关,本研究旨在探索ZNF644基因与另一个中国汉族(湖南)高度近视家系的相关性。方法:收集家系中5例患者临床资料并采集5例患者及2例家系正常成员的外周血,提取基因组DNA,采用PCR扩增ZNF644基因的全部6个外显子及外显子与内含子交界区域,用直接双向测序、BLAST比对进行突变分析。结果:此家系中5例患者的近视屈光度均高于6.00 D,同时部分患者伴发视网膜脱离、白内障等症状,家系其余成员视力正常,符合常染色体显性遗传模式的遗传性高度近视;在ZNF644;基因中发现了6个变异序列,所有变异序列均存在于患者及其正常亲属中,与疾病表型无共分离现象。结论:排除了ZNF644基因外显子突变导致该家系高度近视的可能性。

ZNF644、GRM6和CTNND2基因单核苷酸多态性与高度近视的相关性

目的 探讨江苏汉族人群ZNF644、GRM6和CTNND2基因与高度近视的相关性.方法 采用病例-对照研究.研究对象包括无亲缘关系的114例高度近视患者（双眼眼轴长度≥26 mm）和132例健康对照个体（双眼眼轴长度均在22.0 ～24.0 mm）.样本来源于2012年10月至2013年5月江苏省南通大学附属医院眼科中心的住院患者.本研究通过了南通大学附属医院伦理委员会审查.应用TaqMan MGB荧光探针方法检测ZNF644、GRM6和CTNND2基因14个位点单核甘酸多态性（SNP）.Stata10.0软件进行统计分析.采用x2检验比较病例组和对照组之间等位基因及基因型频率分布是否有差异.结果 ZNF644-rs358695在病例组中稀有等位基因A的频率为41.2％,低于对照组中的50.8％,差异具有统计学意义（P=0.03）,提示等位基因A为保护基因.ZNF644-rs358693在显性模型中,基因型频率分布差异具有统计学意义（P=0.04）.ZNF644-rs358695在隐性模型中,基因型频率分布差异有统计学意义（P=0.02）.ZNF644的ACCG单倍体型在病例组和对照组中单体型频率差异有统计学意义（P=0.02）.GRM6和CTNND2基因的9个SNP位点的等位基因及基因型频率分布在病例组和对照组间均无统计学差异.结论 ZNF644基因突变与高度近视存在关联,提示ZNF644基因在高度近视的发生发展中发挥着重要作用.