ZNRD1基因的克隆及其反义核酸对胃癌耐药细胞阿霉素蓄积的影响

为获得ZNRD1基因的编码区序列 ,构建反义真核表达载体 ,通过检测ZNRD1基因反义核酸转染对胃癌长春新碱耐药细胞SGC790 1/VCR阿霉素 (ADM)积蓄能力的影响 ,评价ZNRD1在抗胃癌细胞多药耐药性方面的应用前景。用PCR方法扩增目的基因序列 ,PCR产物经DNA序列测定证实后 ,采用分子克隆技术 ,将所获目的基因全长cDNA片段按反方向克隆入真核表达载体pcDNA3 1+ 的多克隆位点之间 ,对重组质粒进行酶切鉴定。用脂质体介导法将ZNRD1反义核酸转染SGC790 1/VCR ,流式细胞仪 (FACS)检测SGC790 1/VCR细胞内阿霉素的蓄积量。结果应用PCR反应扩增出特异性片段 ,经DNA序列分析 ,证实与文献报道的ZNRD1基因编码区序列一致 ;构建了反义真核表达载体pcDNA3 1 ZNRD1;转染SGC790 1/VCR细胞后 ,可提高细胞内ADM蓄积量。ZNRD1反义核酸转染后 ,胃癌多药耐药细胞株SGC790 1/VCR对抗肿瘤药物ADM的积蓄作用提高 ,提示ZNRD1反义核酸具有提高耐药细胞株细胞内药物浓度、恢复其药物敏感性、逆转多药耐药性的作用。

ZNRD1小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

目的:探讨转录相关锌带蛋白基因(zincribbondomaincontaining1protein,ZNRD1)作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性。方法:Westernblot检测ZNRD1在白血病细胞中的表达;构建ZNRD1基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL60/VCR细胞,G418筛选稳定转染细胞株;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;Westernblot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白bcl2、Bax和耐药相关蛋白Pgp、MRP的表达变化。结果:ZNRD1在HL60/VCR细胞中的表达明显高于HL60细胞;成功建立了低表达ZNRD1的白血病细胞模型;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达Pgp和bcl2。结论:该小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转了白血病细胞的耐药性。

ZNRD1在肝癌中的表达及对HepG2细胞增殖的影响

[目的]检测ZNRD1基因在肝癌中的表达并探讨其对HepG2细胞增殖的影响。[方法]Westernblot技术检测ZNRD1在7例肝癌组织和相应癌旁组织中的表达;脂质体介导法将ZNRD1的真核表达载体转染肝癌细胞系HepG2,G418筛选后应用Westernblot进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后生长速度的变化。[结果]ZNRD1基因在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织;成功建立了ZNRD1高表达的肝癌细胞模型;转染后的肝癌细胞生长速度明显下降。[结论]ZNRD1基因可能参与肝癌的发生,对肝癌细胞的生长可能起重要调控作用,具备一定的基因治疗应用前景。

锌带蛋白基因ZNRD1高表达胃癌细胞模型的建立

为建立高表达ZNRD1胃癌细胞模型 ,通过分子克隆技术将ZNRD1基因全长cDNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3 1+的多克隆位点之间 ,对重组质粒进行酶切鉴定 ,经显微注射将重组质粒导入人胃癌细胞SGC790 1,G4 18筛选后应用Northernblot检测ZNRD1基因的表达。结果经酶切鉴定证实正确地构建了真核表达质粒 ,转染SGC790 1细胞后获得有效表达。表明已成功地构建了ZN RD1基因真核表达载体 ,并经显微注射法建立了高表达锌带蛋白基因ZNRD1的胃癌细胞模型 ,为深入研究ZNRD1的作用和机制奠定了基础。

锌带蛋白(ZNRD1)小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

为探讨以锌带蛋白(ZNRD1)基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,以Western blot检测ZNRD1在白血病细胞中的表达;构建ZNRD1基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL-60/VCR细胞,G418筛选稳定转染细胞株;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;western blot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和耐药相关蛋白P-gp,MRP的表达变化。结果表明,ZNRD1在HL-60/ VCR细胞中的表达明显高于HL-60细胞;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达P-gp 和Bcl-2。结论:该小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性。

Effect of ZNRD1 gene antisense RNA on drug resistant gastric cancer cells

AIM: To investigate the expression level of ZNRD1 gene in gastric cancer cells SGC7901 and gastric cancer MDR (multidrug resistant) cells SGC7901/VCR, and to observe the drug sensitizing and proliferation effect of ZNRD1 antisense nucleic acid transduction on SGC7901/VCR cells.METHODS: Amplification of sequences encoding ZNRD1 from SGC7901/VCR cDNA by PCR. The levels of ZNRD1 mRNA expression were demonstrated using semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Eukaryotic expression vector pcDNA3.1-anti ZNRD1 was constructed and transfected into SGC7901/VCR cells by lipofectamine. Immunochemical method was used to detect the expression of protein in SGC7901/VCR cells and transfectants. The cell cycle alteration and the intracellular adriamycin (ADM) accumulation were observed by FACS.Growth curve and drug sensitization of cells for vincristine (VCR) were analyzed with MTT assay.RESULTS: We cloned the open reading frame of full-length ZNRD1. The expression of ZNRD1 showed higher in SGC7901/VCR than in SGC7901 cells. The antisense ZNRD1 drug-resistant clones were selected after gene transfection.Immunochemical results showed that the expression level of ZNRD1 protein was lower in anti ZNRD1-SGC7901/VCR cells than that in non-transfectants. Comparing to SGC7901/VCR and pcDNA3.1-SGC7901/VCR, anti ZNRD1-SGC7901/VCR showed gradually accumulated in G1 phase, with aconcomitant decrease of cell population in S phase. FACSalso suggested intracellular ADM accumulation increased2fold in SGC7901/VCR cells after transfected with antisenseZNRD1.MTT assay showed that transfectant cells proliferationwas lagged and more sensitive to vcr than non-transfectants.CONCLUSION: ZNRD1 gene displayed highly expression in VCR resistant gastric cancer cells.Expression of ZNRD1 protein was effectively blockde in anti ZzNRD1-SGC7901/VCR cells by gene transfection.ZNRD1 antisense nucleic acid transfection sensitized drug resistant gastric cancer cells to VCR,increased ADM accumulation and inhibited the cells to VCR,incereased ADM accumulation qand inhibited the cells proliferation.ZNRS1 antisense RNA transduction could reverse the MDR of human drug-resistant gastric cancer cell SGC7901/VCR to a degree.

锌带基因ZNRD1在胃癌耐药细胞中的表达和功能

目的 探讨锌带基因ZNRD1在多药耐药胃癌细胞中的表达和作用。方法 应用Northernblot和半定量RT PCR ,观察锌带基因ZNRD1在胃癌细胞SGC790 1及其长春新碱 (VCR)诱导的耐药细胞SGC790 1/VCR中的表达 ;将反义核酸转染SGC790 1/VCR细胞 ,通过免疫组化检测转导细胞与非转导细胞ZNRD1蛋白的表达 ;以流式细胞仪检测细胞周期的变化 ,以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素 (ADM)的药敏性。结果 胃癌耐药细胞SGC790 1/VCR与非耐药细胞相比 ,ZNRD1基因的表达明显增高。转导株antiZNRD1 SGC790 1/VCR细胞的ZNRD1蛋白水平明显低于非转导株 ,G1期细胞比例增加而S期比例减少 ,生长受到抑制 ,且对VCR、ADM的敏感性明显增高。结论 胃癌耐药细胞与非耐药细胞相比 ,ZNRD1基因处于高表达状态。反义核酸转染可有效阻断ZNRD1蛋白的表达 ,在一定程度上逆转人胃癌耐药细胞SGC790 1/VCR的多药耐药性。

PRM1及ZNRD1表达在结肠癌生长侵袭转移中的作用研究

目的 :探讨鱼精蛋白(PRM1)及锌带蛋白(ZNRD1)在结肠癌中的表达及在结肠癌生长侵袭转移中的作用。方法 :RT-PCR检测PRM1及ZNRD1在结肠癌患者和正常人中的表达;ZNRD1过表达细胞系构建及慢病毒包装PRM1-RNAi;MTT法检测细胞活力,transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力,western blot检测Bax,Bcl-2,基质金属蛋白酶(MMP 2),MMP 9的表达。结果 :与正常组比较,结肠癌患者中PRM1表达量过高,ZNRD1表达量较低,差异具有显著性。与正常组比较,PRM1表达下降及ZNRD1表达上升能降低结肠癌细胞RKO活力和迁移侵袭能力,并下调Bcl-2,MMP 2,及MMP 9表达,上调Bax表达。结论 :PRM1及ZNRD1在结肠癌表达异常,并参与结肠癌细胞的生长侵袭转移。

长链非编码核糖核酸ZNRD1-AS1靶向微小核糖核酸-375/Yes相关蛋白1通路调控胃癌细胞株多药耐药的机制

目的:探讨长链非编码核糖核酸ZNRD1-AS1(lncRNA ZNRD1-AS1)在胃癌多药耐药(MDR)中的作用及机制。方法:采用24孔板体外培养胃癌MGC-803细胞株,设空白对照组、MDR组、空载质粒组、lncRNA ZNRD1-AS1过表达组、微小核糖核酸-375模拟物(miR-375 mimic)组及联合干预组。除空白对照组以外,均采用阿霉素梯度浓度法建立MDR株。建立成功以后,lncRNA ZNRD1-AS1过表达组和miR-375 mimic组分别采用慢病毒转染法转染lncRNA ZNRD1-AS1过表达质粒和miR-375 mimic,空载质粒组转染空载质粒与模拟物对照(mimic NC)。共培养48 h,采用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测lncRNA ZNRD1-AS1和miR-375表达,采用蛋白质印迹法(Western blot)实验检测Yes相关蛋白1(YAP1)、哺乳动物不育系20样激酶1(Mst1)、大肿瘤抑制基因-1(Lats1)的蛋白表达,采用噻唑蓝(MTT)实验和流式细胞实验检测细胞的增殖活力与凋亡率,Transwell实验检测MGC-803细胞侵袭能力。结果:各组之间的lncRNA ZNRD1-AS1、miR-375、YAP1表达水平差异均有统计学意义(F=60.465、75.695、63.441,均P<0.05);细胞增殖活力、凋亡率与侵袭数目差异也有统计学意义(F=26.818、63.854、16.323,均P<0.05)。MDR组lncRNA ZNRD1-AS1和YAP1表达水平分别为1.736±0.084和0.825±0.135,高于对照组(1.025±0.036和0.155±0.02),miR-375表达为0.054±0.018,低于对照组(0.128±0.028);细胞增殖活力和迁移数目分别为0.855±0.026和152.5±20.5,高于对照组(0.652±0.015和85.0±15.5),凋亡率为(3.85±1.02)%,低于对照组[(6.55±1.05)%,P<0.05]。lncRNA ZNRD1-AS1过表达组lncRNA ZNRD1-AS1和YAP1表达水平分别为6.582±1.035和1.256±0.185,均高于MDR组,miR-375表达水平为0.015±0.011,低于MDR组;细胞增殖活力和迁移数目分别为0.987±0.030和(202.5±32.5)个,高于MDR组,凋亡率为(2.03±0.62)%,低于MDRMDR组(P<0.05)。miR-375 mimic组lncRNA ZNRD1-AS1和YAP1表达水平分别为0.225±0.086和0.056±0.035,均低于MDR组,miR-375表达水平为32.524±5.254,高于MDR组;细胞增殖活力和迁移能力为0.562±0.085和(80.5±14.6)个,低于MDR组,凋亡率为(18.25±2.10)%,高于MDR组(P<0.05)。共干预组各个指标的变化水平介于lncRNA ZNRD1-AS1过表达组与miR-375 mimic组之间,与两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:lncRNA ZNRD1-AS1能够通过miR-375调节胃癌细胞的行为学特征,从而促进MDR,其机制可能与YAP1介导的Hippo信号通路有关。

bcl-2小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

为了探讨以bcl2基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,构建bcl2基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL60/VCR细胞,在G418筛选后应用Westernblot进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;Westernblot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bax和耐药相关蛋白ZNRD1的表达变化。结果表明:成功构建了bcl2的小干扰RNA载体并转染HL60/VCR;经蛋白质水平检测证实成功建立了bcl2低表达的白血病细胞模型;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达耐药相关蛋白ZNRD1。结论:bcl2小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性。

转录相关锌带蛋白基因在肾癌组织中的表达

目的研究转录相关锌带蛋白基因（ZNRD1）在肾癌及肾脏正常组织中的表达。方法应用免疫组化法，检测71例肾癌组织和24例癌旁正常肾脏组织中ZNRD1蛋白的表达，并分析ZNRD1蛋白表达与肾癌Gleason分级和临床分期的关系。应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法，分别检测20例肾癌及癌旁正常肾脏组织中ZNRD1 mRNA和蛋白的表达。结果免疫组化染色结果显示，ZNRD1蛋自主要定位于细胞核。ZNRD1蛋白在24例肾癌及其相应的癌旁正常肾脏组织中的阳性表达率分别为91．7％（22／24）和20．8％（5／24），差异具有明显的统计学意义（P〈0．01）。ZNRD1蛋白的表达与肾癌Gleason分级和临床分期均无显著的相关性（均P〉0．05）。RT-PCR检测结果显示，ZNRD1 mRNA在肾癌组织中的相对表达量为0．6186，明显高于癌旁正常肾脏组织（0．4273，P〈0．01）。Western blot检测结果显示，ZRND1蛋白在肾癌组织中的相对表达量为0．5623，亦明显高于癌旁正常肾脏组织（0．3885，P〈0．01）。结论ZNRD1可能在肾癌的发生发展中发挥着重要作用。