骨髓增生异常综合征患者ZO-1基因甲基化状态检测的临床意义

本研究探讨紧密连接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)基因异常甲基化在骨髓增生异常综合征(MDS)诊断中基因标志作用的临床意义。采用甲基化特异性-PCR(MS-PCR)方法分析30例健康人骨髓标本及85例MDS患者骨髓标本的ZO-1基因启动子区甲基化状况。结果显示:ZO-1基因在30例健康人标本中均呈完全非甲基化状态;MDS患者骨髓中ZO-1基因甲基化阳性率(56.5%)明显高于健康人,二者差异有统计学意义(p<0.05)。MDS各亚型病人骨髓ZO-1基因启动子区甲基化阳性率均高于健康人,其差异也具有统计学意义(p<0.05)。MDS亚型RA、RAS、RAEB、RCMD间ZO-1基因甲基化阳性率差别无统计学意义(p>0.05)。结论:与健康人相比,MDS病人骨髓中ZO-1基因启动子区呈高甲基化状态并具有特异性。MDS是一种常见的克隆增殖性血液系统疾病,在临床诊断中有时很难与其他疾病相鉴别,而ZO-1基因甲基化模式的改变与MDS的发生密切相关,因此ZO-1基因作为有价值的诊断标志具有重要的临床意义,它可能是一个潜在的血液系统恶性疾病的相关基因。

ZO-1基因甲基化在MDS进展中的意义

目的:探讨ZO-1基因甲基化在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)向急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)转化中的临床意义,为MDS患者的预后评估进一步提供理论依据。方法:采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MS-PCR)方法检测ZO-1基因在正常对照者骨髓标本(normal control,NC)、MDS、AML患者骨髓标本中的甲基化状态。运用亚硫酸氢盐侧序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)方法检测1例MDS系列标本ZO-1基因在其MDS-RA、MDS-RAEB、AML阶段的甲基化状态。结果:ZO-1基因在NC、MDS、AML患者标本中的甲基化阳性率存在明显差异(P=0.000),在NC组未发现甲基化阳性,在AM L组阳性率最高(65.0%)。MDS/AML患者ZO-1基因甲基化阳性组髓系原始细胞比例更高(P=0.000)。1例MDS患者系列标本显示,随着疾病进展,在MDS-RA、MDS-RAEB、AML阶段中,甲基化位点阳性频率存在明显差异(P=0.000),在AML阶段阳性频率最高(64.65%)。结论:ZO-1基因启动子区高甲基化发生于MDS/AML患者中,随着恶性克隆增生,ZO-1基因甲基化阳性率及甲基化位点阳性频率越来越高,在一定程度上预示着MDS疾病进展,进一步提示ZO-1基因甲基化水平可成为监测MDS患者急性白血病转化的新指标。

ZO-1基因甲基化状态在非霍奇金淋巴瘤骨髓检测中的临床意义

目的探讨紧密连接蛋白-1(ZO-1)基因启动子区甲基化状态在非霍奇金淋巴瘤(NHL)检测中的临床意义。方法采用甲基化特异性PCR方法(MS-PCR)分析10例非血液系统肿瘤者骨髓及45例NHL患者骨髓标本的ZO-1基因启动子区甲基化状况。结果ZO-1基因在10例良性血液病及正常人中呈完全非甲基化状态,在39例初治、复发、未完全缓解的淋巴瘤患者中甲基化阳性率53.85%(P<0.05)。在39例初治或复发或未达到完全缓解的NHL患者中28例Ⅲ、Ⅳ期的NHL患者ZO-1基因甲基化阳性率64.29%,11例Ⅰ、Ⅱ期的NHL患者ZO-1基因甲基化阳性率27.27%(P<0.05)。初治、复发患者28例中甲基化阳性16例(57.14%),经治疗达到部分缓解的11例患者中甲基化阳性5例(45.45%),临床缓解的6例患者均为完全非甲基化。结论ZO-1基因启动子区高甲基化与疾病分期及缓解明显相关,它可以作为判断NHL进展和评价预后的辅助指标,并以此指导临床治疗。

慢性粒细胞白血病ZO-1基因启动子区甲基化状态分析及临床意义探讨

目的通过对慢性期及急变期慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓标本中人紧密连接蛋白1(ZO-1)基因启动子区甲基化状态的分析,初步探讨其在CML病情发展变化中的临床意义。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测5例CML慢性期和10例CML急变期患者骨髓标本中ZO-1基因启动子区的甲基化状态。结果在5例CML-CP患者中ZO-1基因启动子区呈非甲基化状态;在7例CML-BP患者中ZO-1基因启动子区呈高甲基化状态,甲基化阳性率为70%(7/10);1例CML患者其慢性期骨髓标本ZO-1基因启动子区呈非甲基化状态,而急变期则呈甲基化状态,经治疗恢复到慢性期时,则又表现为非甲基化状态。结论 ZO-1基因启动子区甲基化状态可能与CML病情发展变化密切相关,可能是一个提示CML急变的分子标志物。

zo-1基因甲基化状态分析在骨髓增生异常综合征鉴别诊断中的意义

为探讨zo-1基因甲基化状态改变在骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndrome MDS)与血液系统非恶性疾病鉴别诊断中的意义,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MS-PCR)及逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测MDS细胞系MUTZ1、1例再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)患者及正常供者的骨髓(normal bone marrow,NBM)。通过甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specificPCR,MS-PCR),对37例MDS-RA患者、20例疑诊MDS患者及55例血液系统非恶性疾病患者骨髓标本进行检测。结果显示:①zo-1基因在MDS细胞系MUTZ1中呈完全甲基化且不表达,在1例AA患者骨髓及NBM中呈完全非甲基化且有表达;②zo-1基因在55例血液系统非恶性疾病患者骨髓标本中呈完全非甲基化状态,在MDS-RA患者骨髓中甲基化阳性率48.6%(18/37),二者差异有统计学意义(p<0.05);③20例疑似MDS患者中zo-1基因甲基化阳性率为35%(7/20)。随访甲基化阳性患者中的2例,均在1年内诊断为MDS。结论:MDS患者骨髓zo-1基因启动子区发生了高甲基化状态的改变,而血液系统良性疾病患者骨髓呈非甲基化状态。zo-1基因启动子区高甲基化在MDS患者骨髓标本中较特异,推测zo-1基因异常甲基化状态可能成为基因标志,它有助于MDS与AA等血液系统良性疾病的鉴别诊断,可应用于临床。

急性白血病zo-1基因启动子区甲基化状态研究

本研究探讨健康人和急性白血病(AL)不同时期患者zo-1基因启动子区甲基化状态差异。采用硫化测序特异性PCR(BS-PCR)方法对白血病细胞系、AL患者及健康人骨髓标本进行zo-1基因启动子区甲基化状况检测。结果显示:在健康人骨髓中呈低甲基化状态(1.9%),初治、复发和完全缓解的AL患者骨髓中zo-1基因呈高甲基化状态,甲基化率分别为93.2%、66.9%及16.4%,明显高于健康人,差异均有统计学意义(p<0.05)。结论:与健康人相比,急性白血病患者骨髓细胞zo-1基因呈高甲基化状态,且AL不同时期的患者中zo-1基因都发生了不同程度的甲基化改变,对zo-1基因甲基化状态的分析有助于监测AL患者疾病的进展。

Zo-1与id4基因异常甲基化在多发性骨髓瘤中的临床意义

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是浆细胞恶性增殖性疾病,常规化疗不能治愈,为探讨zo-1、id4基因异常甲基化在MM诊断、预后、微小残留病检测及治疗中基因标志作用的临床意义,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MS-PCR)方法检测MM细胞系U266、H929及IM9(B淋巴母细胞,MM患者骨髓来源)中zo-1、id4基因的甲基化状况;应用MS-PCR方法分析20例MM患者及6例健康供者骨髓标本zo-1、id4基因启动子区甲基化状况。结果显示:zo-1、id4基因在MM细胞系中均为甲基化阳性(完全甲基化或部分甲基化);zo-1、id4基因在5例健康人标本中均呈完全非甲基化状态;MM患者骨髓中zo-1、id4基因甲基化阳性率分别是50%和85%,二者阳性覆盖率高达95%,二者均阳性的标本阳性率为40%,明显高于健康人(0%),差异均有统计学意义(p<0.05);MM患者不同重链及不同轻链间甲基化阳性率没有统计学差异;MM患者是否具有B组症状并不影响患者的甲基化阳性率,这可能与标本数量有关。结论:MM患者中zo-1、id4基因甲基化状态发生改变并具有特异性,可能是MM新的基因标记。

急性白血病ZO-1基因启动子区甲基化状态分析及其临床意义

目的探讨紧密连接蛋白-1（Zonula oecludem-1，ZO-1）基因启动子区甲基化状态在人急性白血病（AL）发生、发展中的作用及作为通用性基因标志物的临床意义。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）检测白血病细胞系HL60、Molt4、NK92和40例非恶性血液病以及81例AL骨髓ZO-1基因启动子区的甲基化状态。结果ZO-1基因启动子区在白血病细胞系中呈完全甲基化状态；而在40例非恶性血液病标本中均为非甲基化；81例AL标本中甲基化阳性率为60．49％（49／81），其中难治复发组为92．86％（13／14），高于初诊未治疗组65．85％（27／41）及完全缓解组34．62％（9／26）；急性髓细胞白血病组61．54％（32／52）与急性淋巴细胞白血病组58．62％（17／29）比较差异无统计学意义。结论首次证明ZO-1基因启动子区高甲基化状态在人AL中具有较高的特异性，与疾病发生、发展密切相关，可作为一个新的白血病通用分子标志。

儿童神经母细胞瘤ZO-1基因甲基化状态临床意义分析

目的:探讨紧密连接蛋白(zonula occludens protein-1,ZO-1)基因启动子区甲基化状态在儿童神经母细胞瘤检测中的临床意义。方法:将2002-01-15-2012-12-15河北医科大学第四医院儿科35例确诊为神经母细胞瘤(Ⅳ期)患儿的骨髓标本作为研究组,20例非血液肿瘤患儿骨髓作为对照组。采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MS-PCR)方法动态检测研究组与对照组骨髓中ZO-1基因启动子区甲基化状态。逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)法检测两组ZO-1基因mRNA的表达情况,同时用ZO-1基因经MS-PCR扩增后的甲基化条带进行凝胶成像系统荧光强度半定量分析后的荧光强度(integrated option density,IOD)积分值,观察研究组化疗过程中IOD的动态变化。结果:MS-PCR检测结果显示,研究组治疗前32例出现ZO-1基因甲基化条带,阳性率为91.4%(32/35),对照组20例,均呈非甲基化状态,χ2=15.11,P<0.01;动态观察研究组31例ZO-1基因甲基化阳性率,治疗前为90.3%(28/31),化疗早期为80.6%(25/31),化疗后期为71.0%(22/31)。临床完全缓解3例,仍有2例可检出。治疗前与化疗早期、后期比较差异均无统计学意义,χ2=0.4,P=0.819。RT-PCR检测结果显示,研究组治疗前35例提取总RNA,3例见到ZO-1基因表达,阳性率为8.6%(3/35),对照组20例均有表达,阳性率为100.0%(20/20),χ2=16.616,P<0.001。动态观察研究组31例ZO-1基因表达阳性率,治疗前为9.7%(3/31),化疗早期为19.4%(6/31),化疗后期为29.0%(9/31)。临床完全缓解3例,2例未见到ZO-1基因表达。治疗前与化疗早期、化疗后期比较差异均无统计学意义,χ2=2.53,P=0.500。性别(t=0.530,P=0.25)、年龄(r=0.080,P=0.25)与IOD值线性无关。外周血白细胞总数与IOD值线性无关,r=0.093,P=0.25。骨髓中瘤细胞数与IOD值线性相关,且呈正相关,r=0.669,P=0.036 5。结论:ZO-1基因在儿童神经母细胞瘤中呈特异性高甲基化状态,导致该基因表达沉默,动态观察甲基化消失不明显,这与肿瘤恶性程度、发生、发展及转归密切相关,可能是预后不良因素之一。

白血病相关基因zo-1参与白血病发病过程及其机制的初步研究

本研究探讨新的白血病相关基因zo-1在白血病细胞中的作用及其初步机制。应用甲基化PCR方法验证THP-1等白血病细胞中基因zo-1甲基化与白血病的关系,用甲基化PCR及RT-PCR方法验证THP-1等白血病细胞系中基因zo-1甲基化与基因表达的关系。选择基因zo-1高表达的THP-1细胞,用脂质体Oligofectamine将针对基因zo-1的小干扰RNA转染THP-1细胞,RT-PCR方法验证抑制效率,AnnexinV和PI观察细胞凋亡率,PI检测细胞周期,CCK-8检测细胞增殖。结果表明:急性白血病人中基因zo-1呈高甲基化状态,健康人群中基因zo-1不发生甲基化。基因zo-1未甲基化的THP-1细胞系高表达基因zo-1;基因zo-1高甲基化的Molt4及HL-60细胞系中不表达基因zo-1。脂质体Oligofectamine转染针对zo-1的小干扰RNA成功地抑制了THP-1细胞基因zo-1的表达,而不影响THP-1细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡。结论:基因zo-1为白血病相关基因,急性白血病中基因zo-1高甲基化,基因zo-1的甲基化状态调控基因zo-1表达。THP-1细胞中基因zo-1表达缺失不影响细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡。

儿童非霍奇金淋巴瘤ZO-1基因甲基化状态分析及临床意义

目的探讨紧密连接蛋白(ZO-1)基因启动子区甲基化状态在儿童非霍奇金淋巴瘤(NHL)Ⅳ期检测中的临床意义,以进一步寻找病因及早期诊断方法。方法将55例确诊为NHLⅣ期(T细胞型40例,B细胞型15例)患儿的骨髓标本作为病例组,20例非血液肿瘤患儿骨髓标本作为对照组。采用甲基化特异性PCR法(MS-PCR)检测病例组与对照组骨髓中ZO-1基因启动子区甲基化状态,并检测光密度积分值(IOD)。逆转录PCR法(RT-PCR)检测病例组与对照组ZO-1基因mRNA的表达情况。结果 MS-PCR检测结果显示病例组治疗前39例出现ZO-1基因甲基化条带,阳性率为70.9%(39/55),对照组20例均呈非甲基化状态;治疗过程中,行动态观察NHL患儿47例,其中T细胞型32例,B细胞型15例,治疗前ZO-1基因甲基化阳性率分别为72%和67%,两者差异无统计学意义(P>0.05)。T细胞型与B细胞型NHL患儿治疗前与化疗早期、中期比较差异均无统计学意义(P>0.05),而与化疗后期比较差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示病例组中ZO-1甲基化阳性病例均无mRNA表达,对照组患儿均表达ZO-1 mRNA。外周血白细胞总数与ZO-1基因IOD值无直线相关关系(r=0.093,P=0.575);骨髓中恶性肿瘤细胞数与ZO-1基因IOD值呈正相关关系(r=0.669,P<0.001)。结论 ZO-1基因在儿童NHL中呈特异性高甲基化状态,其程度与骨髓中恶性肿瘤细胞数呈正相关。ZO-1基因可能成为新的分子标志,为临床早期诊断、疗效判断、预后评价、微小残留检测提供新的指标。

ZO-1基因与白血病相关性的研究及其在K562细胞中高表达意义的探讨

目的探讨白血病细胞ZO-1基因的表达、甲基化情况及其与白血病发生的相关性。方法应用基因组限制性酶切扫描（RLGS）技术自白血病小鼠标本中钓取ZO-1基因，用甲基化PCR方法检测白血病细胞系Molt4、HL-60、K562细胞及白血病患者原代白血病细胞及正常人外周血单个核细胞ZO-1基因甲基化水平，用RT—PCR方法检测ZO-1基因表达水平，并对高表达ZO-1基因的K562细胞进行小干扰RNA（siRNA）靶向干扰，然后用Northern blot方法验证ZO-1基因抑制效率，用CCK-8检测细胞增殖情况，膜联蛋白V（Annexin V）和碘化丙锭（PI）双染色法观察细胞凋亡率及细胞周期。结果采用RLGS技术从白血病小鼠标本中成功钓取ZO-1基因。原代白血病细胞及Molt4、HL-60细胞ZO-1基因呈高甲基化状态，ZO-1基因表达水平较正常人外周血细胞明显下降或不表达。正常人外周血单个核细胞ZO-1基因不发生甲基化，ZO-1基因高表达。K562细胞高表达ZO-1基因，未见ZO-1基因甲基化；去甲基化药物可以诱导Molt4及HL-60细胞重新表达ZO-1基因。经ZO-1小干扰RNA干预的K562细胞ZO-1基因的表达明显降低，但并不影响细胞的增殖及凋亡。结论绝大多数急性白血病细胞中ZO-1基因呈高甲基化状态，表达明显降低，ZO-1基因是一个白血病相关基因。其在K562细胞中高表达的意义尚不明确。

猪紧密连接蛋白1基因克隆及其shRNA片段的筛选

试验旨在筛选有效抑制猪紧密连接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)基因表达的shRNA干扰片段,为后期利用RNA干扰技术深入了解ZO-1基因在猪卵母细胞成熟过程中的功能奠定基础。本研究首先克隆了猪ZO-1基因,并构建了其真核表达载体,而后筛选了有效抑制ZO-1基因表达的shRNA干扰片段。结果表明,猪ZO-1基因编码区长度为3 036bp,多重序列比对结果显示,猪ZO-1基因核苷酸序列与牛、羊、马和人相应序列的同源性分别为88%、88%、87%和85%。构建的pDsRed-N1-ZO-1真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的RFP红色荧光蛋白表达。将靶质粒与shRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞48h后,与对照组相比,可观察到红色荧光表达得到抑制。实时荧光定量PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对猪ZO-1基因表达均有抑制效果,其中ZO-1shRNA201的抑制效果显著高于ZO-1shRNA1276(77.8%和67.0%,P<0.05)。

试验条件下厚朴对鸡柔嫩艾美耳球虫病的防治作用

为了评价厚朴及厚朴与益生菌联用对鸡柔嫩艾美耳球虫病的防治作用,试验将90只1日龄广西三黄鸡随机分为6组,即阴性对照组、阳性对照组、地克珠利组(地克珠利,0.2 mL/L饮水)、厚朴组(4%厚朴粉末拌料)、厚朴+益生菌组(4%厚朴粉末+0.2%益生菌拌料)和益生菌组(0.2%益生菌拌料),在雏鸡25日龄时将厚朴粉和益生菌按不同的比例加入饲料中,饲喂至35日龄。雏鸡于28日龄时,除阴性对照组外均人工感染柔嫩艾美耳球虫。试验结束后称量各组雏鸡体重,统计盲肠病变记分、每克粪便中卵囊数(OPG)和抗球虫指数(ACI),之后进行盲肠组织病理学观察,测定肠道ZO-1、Occludin基因的相对表达量。结果表明:在球虫感染情况下厚朴+益生菌组末重高于阳性对照组;厚朴组和厚朴+益生菌组盲肠病变记分显著低于阳性对照组(P<0.05),同时可以降低感染雏鸡OPG;厚朴组ACI为140.35,厚朴+益生菌组ACI为144.44,均达到中等抗球虫水平。厚朴组和厚朴+益生菌组ZO-1、Occludin基因的相对表达量均高于阳性对照组,但差异不显著(P>0.05)。说明日粮中单独添加厚朴干燥粉或联合益生菌使用均可缓解感染球虫鸡的病变情况,对防治鸡球虫病具有一定效果。