抑癌基因PTEN对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖和转移的抑制作用

背景与目的:研究表明,抑癌基因PTEN不仅能抑制肿瘤细胞的增殖,还能抑制其转移,但其机理还不甚明了。本文研究抑癌基因PTEN对人乳腺癌ZR-75-1细胞增殖和转移的作用。方法:以脂质体介导法分别将野生型PTEN质粒和磷酸酶缺陷的PTEN质粒转染人乳腺癌ZR-75-1细胞,用MTT法测定细胞增殖抑制率;转染后用嘌呤霉素筛选阳性克隆。用Western blot法检测细胞中PTEN蛋白的表达。通过细胞-基质粘附实验和人工重组基底膜侵袭实验,检测细胞粘附抑制率与侵袭抑制率。结果:野生型PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞增殖明显被抑制,并伴有部分细胞凋亡;该细胞与未经转染的和磷酸酶缺陷的PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞比较,细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(42.7% vs.0%及2.7%,P<0.01),细胞增殖抑制效应随细胞培养时间与质粒浓度的增加而增强。而磷酸酶缺陷的PTEN质粒转染的与未经质粒转染的ZR-75-1细胞比较,细胞增殖抑制率差异无统计学意义(2.7%vs.0%,P>0.05)。在两种PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞中PTEN蛋白均明显表达,其中转染野生型PTEN质粒的细胞的粘附抑制率与侵袭抑制率分别达65.7%和70.4%,而转染磷酸酶缺陷的PTEN质粒的ZR-75-1细胞的粘附抑制率与侵袭抑制率分别只有8.8%和6.9%(P<0.05)。结论:具有双特异磷酸酶活性的野生型PTEN基因对ZR-75-1细胞的增殖和转移有一定的抑制作用。

TOX3基因RNAi慢病毒载体的构建及对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖的影响

旨在构建TOX3基因RNAi慢病毒载体并观察其对人乳腺癌ZR-75-1细胞增殖能力的影响。针对TOX3基因设计干扰靶序列,构建载体,测序正确后进行慢病毒包装及滴度测定。转染ZR-75-1细胞,荧光显微镜下观察表达GFP的细胞数目,实时荧光定量PCR及Western blot实验验证转染后ZR-75-1细胞中TOX3 mRNA和蛋白的表达。MTT及平板单克隆实验检测TOX3对ZR-75-1细胞增殖能力的影响。结果显示,各组载体序列正确,病毒滴度均>2×10^8 TU/mL,表达GFP细胞数目均可达95%以上。各干扰组TOX3 mRNA及蛋白表达水平均降低,其中TOX3-shRNA-3组干扰效果最佳,转染后ZR-75-1细胞的增殖和单克隆形成能力下降。成功构建TOX3基因的RNAi慢病毒载体,沉默TOX3后ZR-75-1细胞的增殖能力下降。

PTEN磷酸酶活性对乳腺癌细胞ZR-75-1迁移能力的影响

目的:探求PTEN蛋白的磷酸酶活性对乳腺癌细胞ZR-75-1转移能力的影响。方法:采用脂质体介导法分别将野生型PTEN质粒(wt-PTEN)、磷酸酶失活的PTEN质粒(G129R-PTEN)和只具有蛋白磷酸酶活性的PTEN质粒(G129E-PTEN)转染PTEN基因缺失的人乳腺癌细胞株ZR-75-1,Western印迹法检测PTEN蛋白及P397-FAK的表达水平,体外细胞划痕实验观察PTEN磷酸酶活性对ZR-75-1细胞迁移能力的影响,细胞基质黏附试验和人工重组基底膜侵袭试验测定PTEN质粒转染和未转染的ZR-75-1细胞的黏附抑制率和侵袭抑制率,免疫组化法检测MMP-2的水平。结果:wt-PTEN、G129R-PTEN及G129E-PTEN3种质粒均成功转染ZR-75-1细胞并有PTEN蛋白的表达,其中wt-PTEN、G129E-PTEN均能抑制ZR-75-1细胞迁移;wt-PTEN和G129E-PTEN转染细胞之间的黏附抑制率和侵袭抑制率或侵袭细胞相对数均无显著性差异,但与G129R-PTEN转染的和未经转染的ZR-75-1细胞相比有显著性差异(P<0.01)。wt-PTEN和G129E-PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞其P397-FAK水平均显著低于G129R-PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞;wt-PTEN与G129E-PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞MMP-2水平对比于G129R-PTEN质粒转染的和未经质粒转染的ZR-75-1细胞有显著性差异(P<0.01)。结论:具有双特异磷酸酶活性的野生型PTEN基因和只具蛋白磷酸酶活性的PTEN基因均能抑制乳腺癌细胞ZR-75-1的迁移,而磷酸酶失活的PTEN基因则无此作用。

抑癌基因PTEN抑制乳腺癌ZR-75-1细胞转移作用机制的探讨

目的探讨抑癌基因PTEN抑制乳腺癌细胞ZR-75-1转移的作用机制。方法用脂质体介导法分别将野生型PTEN质粒(wt)、磷酸酶活性缺失的PTEN质粒(G129R)和只具蛋白磷酸酶活性的PTEN质粒(G129E)转染PTEN基因缺失的乳腺癌细胞ZR-75-1。转染细胞以嘌呤霉素筛选后,用PCR和Western-blot分别检测PTEN基因及其蛋白;通过黏附、侵袭实验,比较3种质粒转染细胞和未转染细胞之间的黏附、侵袭能力的差异;用Western-blot法检测各组转染细胞总的黏着斑激酶(FAK)和磷酸化黏着斑激酶(P397-FAK)的表达水平;以免疫组化法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和E-钙连素(E-Cd)的表达,并用RT-PCR检测各组转染细胞的p53 mRNA水平。结果3种质粒均成功转染ZR-75-1细胞,并证实3种转染细胞内均有PTEN基因存在及PTEN蛋白表达;wt、G129R、G129E等3种质粒转染的细胞黏附抑制率分别为65.7%、8.8%和43.5%;侵袭抑制率分别为70.4%、6.9%和63.5%。将wt或G129E转染细胞的黏附抑制率及侵袭抑制率与G129R转染细胞的比较,均有显著性差异(P<0.05);但wt与G129E转染细胞比较,均无显著性差异(P>0.05)。3种转染细胞总FAK水平虽无显著性差异(P>0.05),但wt和G129E转染细胞其P397-FAK和MMP-2水平都显著低于G129R转染细胞(P<0.05)。3种转染细胞间的E-Cd水平未见显著差异。RT-PCR分析显示,wt、G129E和G129R3种转染细胞p53 mRNA水平无显著性差异,但均显著高于未转染细胞。结论野生型PTEN基因所表达的蛋白具脂质和蛋白双特异磷酸酶活性,对乳腺癌细胞ZR-75-1的转移具有抑制作用,其机制与磷酸酶活性有关,其中蛋白磷酸酶活性可能起主要作用。

炒薏苡仁油对乳腺癌MCF-7和ZR-75-1细胞凋亡的影响及其相关氧化应激机制

目的探索炒薏苡仁油对人乳腺癌MCF-7和ZR-75-1细胞凋亡的影响及其相关氧化应激机制。方法用不同浓度炒薏苡仁油(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL)处理人乳腺癌MCF-7和ZR-75-1细胞36 h和48 h后,采用MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,RT-PCR法检测细胞中相关基因CDK4、Cyclin A、Cyclin E、Bax、Bcl-2的表达,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达,采用ELISA法检测细胞活性氧(ROS)及其相关氧化应激指标SOD、GPX、CAT的含量。结果不同浓度炒薏苡仁油处理48 h后,MCF-7和ZR-75-1细胞活力显著下降(P<0.05或P<0.01),细胞凋亡率随着给药浓度的升高呈降低趋势。PCR结果显示CDK4、Cyclin A、Cyclin E、Bcl-2表达显著下调(P<0.05或P<0.01),Bax表达显著上调(P<0.05或P<0.01)。Western blot结果显示Bcl-2表达显著下调(P<0.01),Bax表达显著上调(P<0.01)。细胞内ROS及其相关氧化应激指标SOD、GPX、CAT含量显著增加(P<0.05或P<0.01),且各指标值大小具有浓度依赖性。结论炒薏苡仁油具有抗乳腺癌作用,其机制可能是促进细胞内ROS及其相关氧化应激指标释放,下调Bcl-2和上调Bax的表达。

^(18)F-FES小动物PET/CT评价不同乳腺癌模型雌激素受体表达的差异

目的:用16α-18F-17β-雌二醇(18F-FES)小动物PET/CT评价不同类型乳腺癌模型雌激素受体(ER)表达的差异。方法:用ER阳性人乳腺癌细胞(ZR-75-1、MCF-7)和阴性细胞(MDA-MB-231)构建荷瘤裸鼠动物模型。阳性组每组各10只,接种前3 d植入雌激素缓释片,再将细胞与基质胶混合液接种于乳腺脂肪垫,成瘤后显像前3 d取出缓释片。阴性组5只,直接将细胞悬液接种于乳腺脂肪垫。当肿瘤长至长径5 mm左右时行18F-FES PET/CT显像,用%ID/gmax定量ER表达,然后用免疫组化测定并比较ER结果。数据分析采用单因素方差分析。结果:ZR-75-1、MCF-7和MDA-MB-231的瘤体成瘤率分别为100%(10/10)、70%(7/10)和100%(5/5),瘤体随时间延长而增大,但三组之间差异无统计学意义(P>0.05),18F-FES%ID/gmax分别为6.6±1.0、3.3±0.5和1.1±0.1,三组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。T/M比值分别为4.2±0.3、2.6±0.2和1.1±0.1,三组之间差异均有显著统计学意义(P<0.001)。18F-FES显像结果与免疫组化结果呈正相关(%ID/gmax:r2=0.65,P<0.001;T/M:r2=0.87,P<0.001)。结论:18F-FES PET/CT的%ID/gmax能准确评价不同类型荷人乳腺癌模型的ER表达水平,从而为进一步研究乳腺癌内分泌疗效提供了一种活体、无创、动态的分析方法。

内皮素受体B基因过表达对乳腺癌ZR-75-1细胞活力和周期的影响

目的探讨过表达内皮素受体B(EDNRB)基因对人乳腺癌ZR-75-1细胞活力和细胞周期的影响。方法设计EDNRB基因特异性引物,与GV492载体连接构建含EDNRB基因全长序列的过表达载体,慢病毒包装后转染ZR-75-1细胞,构建稳定过表达EDNRB的乳腺癌细胞系。用半定量逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测EDNRB mRNA和蛋白的表达水平,用噻唑蓝法检测EDNRB过表达对细胞生长的影响,用流式细胞术检测EDNRB过表达对细胞周期的影响,用蛋白质印迹法检测EDNRB过表达对细胞周期相关蛋白表达的影响。结果未处理组、GV492转染组和GV492-EDNRB转染组的EDNRB mRNA表达水平分别为0.22±0.13、0.13±0.10和1.79±0.12,EDNRB蛋白相对表达水平分别为0.75±0.04、0.80±0.21和1.43±0.10,GV492-EDNRB转染组的上述指标与未处理组和GV492转染组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。未处理组和GV492-EDNRB转染组的细胞存活率分别为0.98±0.58和0.62±0.15,G1期细胞百分比分别为(52.10±1.25)%和(63.35±1.06)%,抑癌蛋白53(p53)蛋白相对表达水平分为0.19±0.03和0.36±0.05,p21蛋白相对表达水平分为0.42±0.04和0.78±0.17,细胞周期蛋白1(CCND1)蛋白相对表达水平分为0.34±0.11和0.79±0.27,周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)蛋白相对表达水平分为0.83±0.14和0.36±0.01,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论本实验成功构建了EDNRB基因过表达的乳腺癌ZR-75-1细胞系;EDNRB过表达抑制了ZR-75-1细胞生长,并将细胞周期阻滞在G1期,其机制可能与p53-p21-CCND1/CDK4通路有关。

人乳腺癌ZR-75-1细胞中RNA结合蛋白38对孕激素受体表达的调节作用及其机制

目的明确乳腺癌细胞株ZR-75—1中RNA结合蛋白38（RNPCI）的表达对孕激素受体（PR）表达的调节作用。方法采用慢病毒转染法过表达RNPCI基因，以实时荧光定量PCR（qRT—PCR）和Westernblot法检测RNPCI调节PR表达的情况；以放线菌素实验研究RNPCI调控PR表达的机制。采用免疫组化法检测80例乳腺癌组织中RNPCI蛋白和PR蛋白的表达。结果免疫组化检测结果显示，在PR蛋白表达阳性的29例乳腺癌组织中，RNPCI蛋白高表达16例；在PR蛋白表达阴性的51例乳腺癌组织中，RNPCI蛋白低表达41例。qRT—PCR检测结果显示，过表达RNPCI组和过表达对照组乳腺癌ZR-75-1细胞中，PRmRNA的相对表达量分别为1．764±0．028和1．001±0．037．差异有统计学意义（P〈0．01）；而干扰RNPCI组和干扰对照组乳腺癌ZR-75-1细胞中PRmRNA的相对表达量分别为0．579±0．007和1．000±0．002，差异有统计学意义（P〈0．01）。Westernblot法检测结果显示，在乳腺癌ZR-75—1细胞中，过表达RNPCI可使PR蛋白的表达增加；而敲除RNPCI的表达后，PR蛋白的表达减少。放线菌素实验结果显示，乳腺癌ZR-75—1细胞过表达RNCPl后，PRmRNA的稳定性增加，其半衰期由过表达对照组的4．0h增加为6．5h；而敲除RNPCI的表达后，PRmRNA的稳定性降低，其半衰期由干扰对照组的4．1h降为3．0h。结论RNPCI在调节乳腺癌ZR-75-1细胞PRmRNA和蛋白的表达中发挥重要作用。

稳定低表达乳酸脱氢酶A对HepG2和ZR-75-1细胞糖代谢、增殖和迁移的影响

目的通过构建乳酸脱氢酶A(LDHA)稳定低表达的HepG2和ZR-75-1细胞系,观察LDHA表达降低对肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞ZR-75-1糖代谢、增殖、迁移的影响。方法采用慢病毒介导的LDHA-shRNA载体,将新构建质粒转染至HEK293T细胞中检测抑制效果,实时定量PCR检测LDHA mRNA水平,Western印迹检测蛋白水平。对经嘌呤霉素筛选后感染慢病毒的稳定低表达LDHA的HepG2和ZR-75-1细胞进行功能测定,利用糖代谢相关试剂盒检测敲低后肿瘤细胞中糖摄取、三磷酸腺苷(ATP)、乳酸脱氢酶(LDH)、乳酸水平;利用生长曲线实验和克隆形成实验检测LDHA基因表达降低对细胞增殖的影响;利用划痕实验检测LDHA表达降低对细胞迁移能力的影响。结果实时定量PCR及Western印迹结果显示,LDHA表达在mRNA水平及蛋白水平上均受到了抑制;糖代谢相关试剂盒检测结果表明稳定低表达LDHA的肿瘤细胞中糖摄取、ATP水平、LDH和乳酸水平均明显下降;生长曲线实验(CCK-8法)和克隆形成实验显示,慢病毒介导的LDHA shRNA能明显抑制肿瘤细胞的增殖;划痕实验显示,敲低LDHA后HepG2和ZR-75-1细胞迁移能力受到了明显抑制。结论 LDHA表达降低可明显抑制肿瘤细胞中糖摄取、ATP、LDH和乳酸水平并且抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。

CTAB调控乳腺癌干细胞抑制迁移

乳腺癌转移是限制其临床治疗的主要因素.十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为一种潜在的抗癌化合物具有明显的抗肿瘤作用.使用划痕和Transwell实验证明了CTAB可抑制ZR-75-1细胞迁移.乳腺癌干细胞是导致乳腺癌转移的一个重要因素.通过免疫荧光、流式细胞术和细胞成球实验证明CTAB降低了乳腺癌干细胞比例,并且抑制了干性标记物CD44和CD133的表达.实验证明CTAB抑制乳腺癌干细胞并且抑制乳腺癌细胞迁移.