表阿霉素和紫杉醇单用或联合使用对乳腺肿瘤细胞ZR75-1的体外细胞毒性

目的观察表阿霉素联合紫杉醇方案对乳腺肿瘤细胞的增殖抑制作用。方法采用结晶紫染色法,比较表阿霉素及紫杉醇单用及联合应用对乳腺癌细胞ZR75-1的增殖抑制率。结果 1 mg·ml-1表阿霉素和3 mg·ml-1紫杉醇联合作用40 h,其联合效应Q值为0.935。结论 1 mg·ml-1表阿霉素和3 mg·ml-1紫杉醇联合应用40 h对ZR75-1细胞的增殖抑制具有相加作用。

重组人TNF-α诱导乳腺癌细胞ZR75-1凋亡及其机制的初步研究

背景与目的:肿瘤坏死因子α(TNF-α)是抗肿瘤活性较强的细胞因子,是重要的抗肿瘤生物治疗制剂之一,但由于其对人体有较严重的副作用,临床应用受到了限制。为了降低其毒副作用,同时保留其抗肿瘤能力,TNF-α的突变体——突变型471TNF-α应运而生。本研究对重组人突变型471rhTNF-α与野生型rhTNF-α蛋白的抗肿瘤能力进行了比较,并对突变型471rhTNF-α诱导ZR75-1细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究。方法:以乳腺癌细胞系ZR75-1为靶细胞,以基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析100"g/L突变体471rhTNF-α与100"g/L野生型rhTNF-α作用ZR75-1细胞12h,肿瘤细胞发生凋亡的情况;利用以ELISA为基础的TransAMTMNF-κBp65试剂盒检测10μg/L、50μg/L和100μg/L突变体471rhTNF-α或野生型rhTNF-α作用ZR75-1细胞4h后核因子NF-κB的活化情况。结果:2%琼脂糖凝胶电泳显示,突变体471rhTNF-α处理组的ZR75-1细胞基因组DNA呈现明显的“ladder”状分布,野生型rhTNF-α处理组的“ladder”条带明显减弱;流式细胞仪分析显示,突变型471rhTNF-α诱导的凋亡峰面积为(44.6±3.6)%,野生型rhTNF-α诱导凋亡峰面积占(24.7±2.7)%,两组差异具有显著性(P<0.05);从细胞周期结果来看,突变型471rhTNF-α处理组G1期细胞占(66.6±4.2)%,比例明显高于对照组[(34.8±3.1)%]与野生型hTNF-α[(46.2±3.8)%],S期细胞占(33.2±2.9)%,比例明显低于对照组[(50.1±3.8)%]与野生型hTNF-α处理组[(45.7±2.9)%],G2期细胞比例为(0.2±0.1)%,明显低于对照组[(15.1±2.2)%]和野生型hTNF-α处理组[(8.1±3.1)%],而野生型hTNF-α处理组与对照组相比均无明显变化(P>0.05)。NF-κB活化检测结果显示,50"g/L野生型rhTNF-α处理ZR75-1细胞4h后NF-κB的活化量(A值为3.27±0.1)明显高于突变型471rhTNF-α处理组(A值为1.51±0.2)。结论:突变型471rhTNF-α比野生型rhTNF-α具有更强的诱导ZR75-1细胞凋亡的能力;ZR75-1细胞内NF-κB活化明显受限是突变型471rhTNF-α诱导凋亡能力增强的主要原因之一。

氯化镉对ZR75-1细胞DNA错配修复活性的抑制效应

目的:研究氯化镉(Cd Cl2)暴露对人乳腺癌细胞ZR75-1 DNA错配修复(DNA MMR)活性的影响。方法:用0、10、20、30、40、50 μmol/L的Cd Cl2对ZR75-1细胞染毒48 h和72 h后,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测各组ZR75-1细胞的存活率。以5、10、15 μmol/L的Cd Cl2分别作用于ZR75-1细胞48 h后,各组平行转染同源、异源质粒,通过流式细胞术检测相对荧光表达率来评估各组ZR75-1细胞的DNA MMR活性;同时利用实时荧光定量PCR技术检测Cd Cl2暴露后DNA MMR活性相关基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS1 m RNA的表达。结果:MTT结果显示,与对照组相比,10、20 μmol/L Cd Cl2对ZR75-1细胞的存活率无显著影响(P>0.05),而30、40、50 μmol/L Cd Cl2对细胞有显著毒性作用(P<0.05),且表现出浓度和时间依赖效应。流式细胞术检测显示,与对照组相比,5、10、15 μmol/L Cd Cl2暴露均显著降低了ZR75-1细胞的DNA MMR活性(P<0.05)。荧光定量PCR技术检测结果显示,5、10、15 μmol/L Cd Cl2处理组中MLH1、MSH2、MSH6、PMS1 m RNA表达水平总体上升,变化趋势均为随Cd Cl2暴露浓度增加先上升后下降。结论:对细胞存活率无影响的Cd Cl2暴露可显著抑制ZR75-1细胞的DNA MMR活性,并上调DNA MMR活性相关基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS1 m RNA的表达水平。

二甲双胍对人乳腺癌ZR75—1细胞增殖及凋亡的调控

目的探讨抗糖尿病药物二甲双胍对人乳腺癌ZR75—1细胞增殖抑制及凋亡诱导的作用。方法3种不同浓度的二甲双胍处理乳腺癌ZR75—1细胞24、48h，MTT法检测ZR75-1细胞的增殖活性，流式细胞仪（FcM）检测48h后各浓度二甲双胍诱导细胞凋亡情况及对细胞周期的影响。结果与对照组相比，二甲双胍以时间、剂量依赖性方式抑制ZR75—1细胞增殖（P〈0．05）。作用48h后，二甲双胍诱导ZR75—1细胞凋亡并阻断了细胞周期进程，凋亡率随二甲双胍浓度的增加而增加（P〈0．05），且随着药物浓度的增加，G0／G1期细胞比例逐渐增加，S期及G2／M期细胞比例逐渐下降（P〈0．05）。结论二甲双胍可显著抑制ZR75—1细胞的增殖，诱导其凋亡，阻滞细胞周期进程。

人GFP-Sp1基因真核表达载体的构建及其对细胞周期调控作用研究

背景乳腺癌目前已经成为女性发病率最高的恶性肿瘤,因此寻找有效治疗靶点进而控制肿瘤发生发展至关重要。目的构建带绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-C1的Sp1真核表达载体,在获得pEGFP-Sp1融合表达蛋白后,对其功能进行验证。方法以人乳腺文库为模版,采用PCR技术扩增出Sp1的CDS区编码序列技术,将其插入到pEGFP-C1载体中,经酶切和测序验证成功后,转染至人胚肾293T细胞,蛋白质印迹法检测该融合蛋白的表达情况;分别转染pEGFP-C1、pEGFPSp1到人乳腺癌细胞ZR75-1细胞中,通过荧光显微镜观察Sp1蛋白在细胞中定位情况,通过逆转录PCR检测细胞周期基因转录水平。结果经双酶切及测序鉴定证明pEGFP-Sp1质粒构建成功,蛋白印迹检测蛋白表达成功;荧光显微镜结果显示Sp1主要定位于人乳腺癌细胞ZR75-1细胞的细胞核中,逆转录PCR结果显示过表达Sp1可改变细胞周期相关基因转录水平。结论通过构建真核表达载体pEGFP-Sp1,可确定Sp1蛋白在人乳腺癌细胞ZR75-1细胞中表达,且主要表达于细胞核中。同时Sp1可下调Cyclin D2与CDK6 mRNA水平,上调Cyclin G2和p18 mRNA水平。综上所述,我们的结果表明Sp1在细胞周期通路中发挥重要的功能,这为进一步深入研究Sp1转录因子的功能提供基础。

半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白1的基因克隆真核表达及细胞定位

目的构建带FLAG标签的半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白1(CRP1)的真核表达载体,明确该融合蛋白在人胚肾293T细胞、肝癌HepG2细胞和乳腺癌ZR75-1细胞中的表达及定位情况。方法采用PCR技术从乳腺cDNA文库中扩增出人CRP1基因,并将其插入到pCMV-Tag2B表达载体中;将重组质粒转染人胚肾293T细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌ZR75-1细胞,Western blot法检测转染细胞的表达情况;荧光显微镜观察pCMV-FLAG-CRP1在人胚肾293T细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌ZR75-1细胞中的定位。结果双酶切和测序鉴定表明,pCMV-FLAG-CRP1真核表达质粒构建成功;Western blot法检测pCMV-FLAG-CRP1转染293T细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌ZR75-1细胞后成功表达;荧光显微镜下观察,在293T、HepG2、ZR75-1细胞中,CRP1在细胞质和细胞核中均有分布,且胞质信号强于胞核。结论成功构建pCMV-FLAG-CRP1真核表达载体,CRP1可在不同细胞中的胞质和胞核表达。

带myc标签的人HER2基因真核表达载体的构建及其生物学功能

目的构建人类HER2基因的真核表达载体,并对其促进乳腺癌细胞增殖效果及靶向药物敏感性进行验证。方法采用PCR技术扩增出HER2基因,将其插入到pXJ-40-myc载体中,酶切和测序验证后,将其转染到乳腺癌ZR75-1细胞中,Western blot法检测其表达情况;CCK8法测定细胞生长曲线;加入靶向药物曲妥珠单克隆抗体后,观察转染细胞对药物的反应。结果酶切和测序结果证实表达质粒构建成功;Western blot法结果显示,myc-HER2蛋白在转染细胞中成功表达;转染myc-HER2的乳腺癌细胞较空载体细胞生长较快;加入曲妥珠单克隆抗体后,转染myc-HER2的细胞生长明显受到抑制。结论成功构建了带myc标签的HER2基因真核表达载体,为进一步研究曲妥珠单抗的耐药奠定了实验基础。

人miR-139高效真核表达载体的构建及其功能初探

目的构建人miR-139高效真核表达载体,初步探究miR-139在乳腺癌ZR75-1细胞中的功能。方法设计成熟miR-139的PCR引物,扩增包含miR-139成熟序列的基因组序列。将扩增产物亚克隆到真核表达载体PIRES2-EGFP(IE)上,构建miR-139真核表达载体IE-139。将IE-139转染至乳腺癌ZR75-1细胞中,通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-139的表达情况,同时检测过表达miR-139的乳腺癌ZR75-1细胞中癌基因c-Myc、EIF4G2和ZBTB34的mRNA水平。结果酶切、测序结果表明,人miR-139真核表达载体构建成功;qRT-PCR表明,miR-139能在乳腺癌ZR75-1细胞中高效表达(P<0.01),过表达miR-139的乳腺癌ZR75-1细胞中c-Myc和EIF4G2的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),但ZBTB34的下降水平不明显。结论成功构建了人miR-139真核表达载体IE-139,通过qRT-PCR检测,证明该载体能成功实现miR-139的高效过表达,并且miR-139能明显抑制乳腺癌ZR75-1细胞中癌基因c-Myc和EIF4G2的mRNA表达水平,这为进一步研究miR-139的功能及调控靶基因的分子机制奠定了基础。

带GFP标签的SQSTM1真核表达载体的构建及功能验证

目的构建带绿色荧光蛋白报告载体(pEGFP-C1)的死骨片1(SQSTM1/P62)真核表达载体,在获得pEGFPSQSTM1融合表达蛋白后,对其功能进行验证。方法以人乳腺文库为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增人SQSTM1基因编码序列,插入到pEGFP-C1载体中,把测序正确的重组质粒转染人胚肾293T细胞,蛋白质印迹法(Western blotting)检测该融合蛋白表达情况;分别转染pEGFP-C1空载体、pEGFP-SQSTM1至乳腺癌细胞ZR75-1,荧光显微镜观察SQSTM1蛋白在细胞中的定位情况;荧光漂白后恢复实验(FRAP)验证乳腺癌细胞ZR75-1中SQSTM1小体荧光漂白后恢复情况。结果重组质粒pEGFP-SQSTM1的基因序列与目的序列完全一致,Western印迹检测蛋白表达成功;荧光显微镜观察SQSTM1的表达,结果显示,表达产物主要以点状小体形式定位于乳腺癌ZR75-1细胞的胞质中;FRAP实验验证乳腺癌细胞ZR75-1中SQSTM1小体激光漂白后绿色荧光可恢复。结论成功构建pEGFPSQSTM1真核表达载体,证实了SQSTM1蛋白在人乳腺癌细胞ZR75-1中表达,表达蛋白以点状小体形式定位于细胞质中,为进一步研究SQSTM1小体的功能提供基础。

DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的构建DEK基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经Bam HⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA(siRNA)表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素(puromycin,puro)筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应(real time-PCR,RT-PCR)和Western印迹分别检验DEK在信使RNA(mRNA)和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明,DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。

溶质载体家族成员SLC25A39基因促进乳腺癌细胞线粒体分裂

目的 构建带Flag标签的人溶质载体家族成员蛋白SLC25A39基因的真核表达载体,在获得FlagSLC25A39融合蛋白表达后,研究SLC25A39表达对人乳腺癌细胞线粒体稳态的影响。方法 以人乳腺文库为模板采用PCR技术扩增出人SLC25A39的编码区序列,双酶切后将其插入到带Flag标签的pcDNA3.0载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,菌液PCR鉴定阳性的克隆再进行质粒提取,测序正确后将重组质粒与空载体分别转染人乳腺癌细胞ZR75-1。Western印迹鉴定SLC25A39目的基因的表达;Mitotracker对乳腺癌细胞的线粒体进行染色,共聚焦显微镜对线粒体进行观察;Western印迹检测线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)的表达变化。结果双酶切鉴定表明,Flag-SLC25A39真核表达载体构建成功;Western印迹验证SLC25A39基因表达成功;激光共聚焦显微镜下观察发现SLC25A39过表达的乳腺癌ZR75-1细胞分裂的线粒体较多;Western印迹证实SLC25A39基因过表达后线粒体分裂蛋白Fis1表达增高,线粒体融合蛋白Mfn1表达减弱。结论 成功构建带Flag标签的SLC25A39基因真核表达载体,该基因可促进人乳腺癌细胞的线粒体分裂,有望成为靶向线粒体治疗乳腺癌的潜在新靶点。

透明质酸介导运动受体真核表达载体的构建及其对乳腺癌增殖和迁移的影响

目的构建透明质酸介导运动受体(HMMR)真核表达重组质粒并在乳腺癌ZR75-1细胞中转染和鉴定,探究HMMR对乳腺癌细胞生长、增殖和迁移的影响。方法采用PCR技术以人乳腺文库为模板扩增HMMR基因并与pcDNA3.0-FLAG载体在EcoRⅤ和XhoⅠ酶切位点进行连接,构建真核表达载体(pcDNA3.0-FLAG-HMMR),并转染乳腺癌ZR75-1细胞;通过Western印迹法、CCK8实验和克隆形成检测HMMR基因表达对ZR75-1生长的影响,划痕实验验证真核表达载体对ZR75-1细胞迁移的影响。结果经酶切鉴定及序列测序验证真核重组表达载体构建成功,并在ZR75-1细胞中表达;并且发现HMMR对ZR75-1细胞的增殖和迁移具有显著的促进作用。结论构建的真核表达载体转染至ZR75-1细胞后,明显促进ZR75-1增殖和迁移,这为研究HMMR基因在乳腺癌发生发展机制奠定了基础。