ZZ domain和APEX2融合蛋白的制备和应用

目的基于免疫球蛋白结合结构域ZZ domain和过氧化物酶APEX2的融合表达,开发一种可以特异性结合免疫球蛋白且具有过氧化氢酶催化活性的新型免疫亲和检测试剂。方法将ZZ domain和APEX2融合表达蛋白——ZZ-APEX2在BL21(DE3)大肠杆菌进行大量表达,并利用IBA公司的strep-Tactin纯化系统进行纯化。通过点印迹和Western blotting检测ZZ-APEX2催化过氧化氢分解并启动鲁米诺发光反应的能力。通过愈创木酚比色法测定ZZ-APEX2的过氧化氢酶活性。结果ZZ-APEX2可以在大肠杆菌中可溶性表达,而且可以通过strep-Tactin系统纯化获取。ZZ-APEX2在室温保存48 h和在-20℃保存2个月均保持着稳定的过氧化氢酶活性,并可以用于Western blotting实验。通过双倒数法作图发现,与常规羊抗兔IgG-HRP和羊抗鼠IgG-HRP二抗相比,ZZ-APEX2具有更大的Kcat(s;)值。结论成功开发了一种分子量小、特异性好、容易大量生产、无需实验动物和繁琐的HRP蛋白提纯步骤的新型免疫亲和检测试剂。

金黄色葡萄球菌功能蛋白的酵母表面展示

利用酿酒酵母表面展示系统,成功地将金黄色葡萄球菌功能蛋白ZZ锚定在酵母表面,并进一步用展示有蛋白ZZ的酵母细胞纯化出兔IgG.以pEZZ18为模板,通过PCR技术克隆了ZZ基因,将ZZ基因通过双酶切连接到穿梭载体pICAS,构建了酵母表面展示载体pICZZ,并将其转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MT8-1中.核酸电泳结果表明ZZ基因成功整合到了酵母基因组中.重组菌经培养,利用免疫荧光染色方法进行染色,显微镜观察表明ZZ蛋白已经展示在酵母细胞表面,流式细胞仪分析结果证实80.4%的酵母细胞表达了ZZ蛋白.利用展示有蛋白ZZ的酵母细胞吸附兔血清中的IgG,洗脱后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电脉,并进行W estern blot免疫印迹,结果表明,此重组酵母细胞纯化的兔IgG比标样兔IgG纯度更高.

免疫球蛋白结合结构域的研究进展

Z结构域,又叫免疫球蛋白结合结构域,是由金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A,SPA)中B结构域改构而成。SPA是从金黄色葡萄球菌的细胞壁中发现的能与多种哺乳动物的抗体相结合的天然蛋白,组成SPA的5个结构域中,以B结构域的抗体结合力及稳定性占绝对优势。将B结构域28～29位敏感性残基Asn-Gly定向诱变成为Asn-Ala后,得到的结构域被称为Z结构域,其稳定性更高,可耐受羟铵和溴化氢的处理。首尾相连的两个Z结构域,被命名为ZZ结构域,具有与SPA相类似的抗体结合容量以及更高的稳定性,可以耐受工业纯化中苛刻的环境。ZZ结构域以其独特的反3α螺旋结构、以及特有的抗体结合能力已广泛应用于外源蛋白的可溶表达及免疫检测、抗体纯化等领域。该文将对ZZ与抗体结合的机制研究以及它在各领域的应用研究进行综述。