Sox and Zfx genes in giant panda

By using PCR cloning techniques, the DNA sequences of the HMG box regions of six Sox genes ( pSox ) and the zinc finger domains of two Zfx genes ( pZfx ) in the giant panda were identified. The giant panda Sox genes fell into two subfamilies, SOX S1 and SOX S2. The pSox and pZfx genes of the giant panda were highly homologous to the corresponding genes in mammals and revealed close substitution rates to those in the primates.

siRNA靶向沉默ZFX基因对肝内胆管癌细胞生物学功能的影响

目的探讨siRNA沉默X染色体连锁的锌指蛋白(ZFX)基因的表达后对肝内胆管癌细胞(HCCC-9810)的增殖、克隆、迁移及侵袭能力的影响。方法通过脂质体lipofectamine 3000介导转染肝内胆管癌细胞株HCCC-9810,抑制ZFX基因在肝内胆管癌细胞系中的表达,RT-PCR检测ZFX基因的mRNA表达水平的变化,Western blot检测ZFX基因的蛋白表达水平的变化。ZFX基因下调后分别用软琼脂克隆形成实验检测克隆形成能力,CCK-8增殖实验检测细胞增殖情况,Transwell检测细胞的迁移、转移情况。结果RT-PCR及Western blot结果表明与Cell组、NC-siRNA组相比,ZFX-siRNA组有效降低了HCCC-9810细胞系ZFX的mRNA水平及蛋白水平的表达。克隆形成实验显示:ZFX基因沉默后,该细胞系克隆形成能力明显减弱。CCK-8增殖实验证明实验组细胞增殖能力明显降低。Transwell实验显示,Cell组、NC-siRNA组细胞迁移、转移能力明显高于ZFX-siRNA组细胞。各组实验中Cell组、NC-siRNA组之间均未见明显差异。结论本实验siRNA成功降低肝内胆管癌细胞系HCCC-9810中ZFX基因的表达并证明ZFX的表达降低后与肝内胆管癌细胞的克隆形成、增殖、迁移、转移能力相关。推测ZFX在肝内胆管癌的发生发展中发挥重要的作用,可作为该基因治疗的新靶点。

辽宁新品系绒山羊ZFX、ZFY基因片段的进化研究与性别鉴定

根据摩弗伦羊(Mouflon)和人(Human)的ZFX、ZFY基因序列以及相关文献设计引物,以雌雄辽宁新品系绒山羊的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增并克隆其ZFX、ZFY基因第11号外显子的部分片段,进行序列测序。结果用NCBI的BLAST,生物软件ClustalX.exe、Mega、BioEdit.exe、DNAClub等进行分析。对辽宁新品系绒山羊(New-breeding cashmere goat)、藏系绵羊(Tibetan sheep)、摩弗伦羊(Mouflon)、马(Horse)、山狗(Coyote)、猪(Pig)、鲸(Whale)、人(Human)和牛(Cow)的ZFX、ZFY基因的外显子同源性进行序列对比分析。用N-J方法构建分子系统树。分析结果表明:ZFX、ZFY基因两者核苷酸同源性达92%,推导的氨基酸同源性为95%。经分析可知,辽宁新品系绒山羊与摩弗伦羊亲缘关系最近,与其他物种的亲缘关系较远。利用限制性内切酶AvaII对辽宁新品系绒山羊ZFX、ZFY基因的PCR产物进行酶切,确定AvaII为ZFX基因上的特异酶切位点,以此对辽宁新品系绒山羊性别进行鉴定。

ZFX基因在骨肉瘤中的表达及其作用机制

目的探讨X染色体偶联锌指蛋白(ZFX)基因在骨肉瘤中的表达及其作用机制。方法采用手术切除后存档的人骨肉瘤组织及瘤旁组织石蜡包埋标本50例,通过Western blot检测其中ZFX的表达。体外培养人骨肉瘤MG63细胞,分别用ZFX小干扰RNA(ZFX-siRNA)和阴性对照(siRNA-NC)转染细胞,以空脂质体转染的细胞作为对照组,各组细胞培养48 h后,用Western blot检测细胞中ZFX、Bcl-2、Bax、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达变化;CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡。结果 ZFX基因在骨肉瘤组织中的蛋白表达显著高于瘤旁组织(P<0.01);siRNA-NC组细胞增殖活力、凋亡率及ZFX、Bcl-2、Bax、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与对照组比较无显著差异(P>0.05);ZFX-siRNA组细胞活力及ZFX、Bcl-2、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于对照组,细胞凋亡率及Bax蛋白表达显著高于对照组(P<0.01)。结论 ZFX基因在人骨肉瘤组织中高表达,可能通过促进人骨肉瘤MG63细胞增殖并抑制其凋亡在其发生发展过程中发挥重要的作用,其机制可能与Wnt信号通路的激活有关。

ZFX、ZFY基因与动物进化关系的分析

本文对ChinaHolsteinZFY,ZFX基因外显子片段进行克隆、测序,并利用NCBI和BLAST犤5、6、7犦与Japaneseblack、Sheep、Horse、Pig、Human的ZFY、ZFX的同一外显子同源序列进行对比分析,结果表明:本文分析的锌指蛋白基因ZFY和ZFX外显子片段在上述各物种间,种属距离越远,种属间SNP的差异越大。对ChinaHolstein及Japaneseblack间的ZFY、ZFX对比分析表明:同种属内不同品种间的SNP也存在差异,但同源性高于种间。同种属或品种内ZFY与ZFX的同源比较ZFY的SNP高于ZFX,ZFY在进化过程中较ZFX更活跃,而ZFX较为保守,该结果与国外多数学者的研究结果一致犤2、3、13犦,对ZFY与ZFX的SNP性质进行研究发现ZFY中的碱基颠换率为16.22%、ZFX为16%.本文结果可作为奶牛胚胎早期性别鉴定的基础方法。

马鹿Zfx/Zfy基因的克隆及序列分析

根据GenBank中公布的牛Zfx/Zfy基因的mRNA序列,设计特异性引物,对马鹿Zfx/Zfy基因进行扩增,并对该序列进行分析。结果表明,克隆得到马鹿Zfx基因序列长为2 115bp,GenBank登录号为KP257294.1,编码696个氨基酸;Zfy基因序列长为2 406bp,GenBank登录号为KU041539,编码801个氨基酸。依据Zfx/Zfy基因氨基酸序列构建进化树,分析表明,马鹿Zfx基因与人的亲缘关系较近,与聚为一类的野牛、藏羚羊、虎、家猫、家牛、家犬、绵羊的亲缘关系稍远;Zfy基因与家牛、野牛、藏羚羊、绵羊的亲缘关系较近,与其他动物及人的亲缘关系较远。本研究首次克隆了马鹿Zfx/Zfy基因,为研究该基因蛋白质的结构和功能奠定了基础。

猪Zfx基因RNAi载体筛选及性控效果的观察

为了研究Zfx基因在精子发生过程中的作用,本研究利用RNA干扰技术针对猪Zfx基因m RNA设计3条si RNA并构建sh RNA干扰载体(p LL3.7/e、p LL3.7/f、p LL3.7/g)。对体外培养生精细胞进行干扰后,通过q RT-PCR测定Zfx基因m RNA表达丰度筛选出有效的干扰片段。然后利用有效的干扰载体进行睾丸注射,开展体内干扰试验。结果表明:构建的3个干扰载体,其中p LL3.7/e、p LL3.7/f对生精细胞Zfx基因的干扰率分别为44%(P<0.05)、56%(P<0.05),而p LL3.7/g对其无干扰效果(P>0.05);用p LL3.7/e、p LL3.7/f进行体内试验,结果显示后代仔猪雄性率率分别为51%(P>0.05),59%(P<0.05)。结论:Zfx基因干扰可以影响猪后代的性别比例,本研究可为今后进一步研究动物性别控制提供依据。

驴Zfx基因CDS序列克隆及序列分析

本研究旨在克隆驴Zfx基因CDS序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的牛Zfx基因mRNA序列(登录号:D84097.1)设计特异性引物,利用RT-PCR技术获取驴Zfx基因CDS序列,并对驴Zfx基因CDS区核苷酸序列和蛋白质结构进行生物信息学分析。结果表明,驴Zfx基因CDS区序列长度为2 403 bp,编码800个氨基酸;驴与马、牛、家犬、白犀牛、马鹿、猫、人、绵羊、黑猩猩的Zfx基因CDS区核苷酸序列同源性分别为99.6%、95.0%、95.3%、97.9%、93.5%、94.9%、95.0%、95.7%和94.9%。对驴及其他9种哺乳动物Zfx基因CDS区的核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,驴与马亲缘关系很近,与白犀牛的亲缘关系次之;同时又与聚在一类的家犬、猫亲缘关系较近,而与绵羊、牛的亲缘关系稍远。Zfx蛋白理论等电点(pI)为5.19,不稳定系数为42.94,消光系数为35 810,属于不稳定的亲水性蛋白,含有60个磷酸化位点,无信号肽及跨膜结构,属于非分泌蛋白。Zfx蛋白α-螺旋、延伸链和无规则卷曲分别为23.12%、20.25%和56.63%,三级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。本试验成功克隆获得驴Zfx基因CDS序列,为后期深入研究该基因及其编码蛋白的结构功能提供依据。

PCR扩增ZFY/ZFX基因鉴定人类干血痕性别

应用 PCR 技术同时扩增人 ZFY 和 ZFX 基因特异的 DNA 序列,在男性血痕中可检测到两种扩增产物,即340bp 长的 ZFY 基因及488bp 长的 ZFX 基因特异 DNA 片段;在女性血痕中仅可检测到488bp 长的 ZFX 基因特异 DNA 片段,据此判定干血痕性别。干血痕的最小检出需要量为0.125μl 血液量的血痕。室温保存10年的血痕可以准确判定性别。ZFY 基因位于 Y 染色体短臂。本方法同时检测两条性染色体,可以避免由于扩增失败或 Y 染色体长臂变异出现的假阴性或假阳性。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳即可区分。

家兔Zfx基因shRNA干扰载体构建及验证

研究主要是为了构建出针对家兔Zfx基因的shRNA重组载体及效果验证。根据家兔Zfx基因mRNA序列特征,设计出3条shRNA片段,再与线性化的pLL 3.7载体进行连接重组,最后经过qRT-PCR检测Zfx基因mRNA表达量筛选出有效重组表达载体并通过体内试验进行效果验证。结果表明:试验组shRNA-c和shRNA-f干扰效率分别为74%和67%,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);试验组shRNA-e干扰效果为17%,与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。用shRNA-c和shRNA-f进行体内试验,结果显示,两试验组雄性率分别为44.92%(P>0.05)和33.16%(P<0.01)。本试验成功构建针对家兔Zfx基因的重组载体,体内试验显示子一代出现性别偏移,说明Zfx基因对动物的性别决定有一定作用,关于导致体内验证出现反转的原因仍需进一步验证。

联合检测SRY和ZFX／ZFY 基因在X－连锁隐性遗传病产前性别诊断中的应用

应用聚合酶链反应联合检测人ＳＲＹ基因和ＺＦＸ／ＺＦＹ基因，进行甲型血友病和进行性肌营养不良症家系３０例高危胎儿的产前性别基因诊断。此方法快速、灵敏、准确，是Ｘ连锁隐性遗传病产前基因诊断中确定性别的理想方法。

应用巢式及复合PCR对小鼠早期胚胎进行性别鉴定

根据小鼠SRY基因,设计并合成内外两对巢式PCR引物;同时,根据ZFY—ZFX基因的同源性,设计 合成其共同的巢式PCR引物,对昆白小鼠组织DNA样品进行了性别鉴定,雄性样品可扩增262bp的SRY基 因和137bp的ZFY-ZFX基因片断,而雌性样品只能扩增137bp的ZFY—ZFX基因片断,其鉴定结果与已知性别 一致。将2-细胞、4-细胞、8-细胞和16细胞胚胎视为微量细胞样品进行PCR扩增,通过常规PCR与巢式PCR、 复合PCR的比较,确立了巢式及复合PCR的扩增体系。结合核型分析和PCR法共鉴定21枚胚胎,其中雄性12 枚,雌性8枚,鉴定准确率为95．2％。

棕背䶄性别的快速鉴定

目的野生棕背因其活动敏捷、性情凶猛、不易抓取,很难从外表对其性别做出准确判断,影响分笼及后期的实验室繁育,拟建立一种快速、准确、简便的性别鉴定方法。方法以棕背的新鲜被毛为材料,Chelex-100提取毛囊DNA,利用PCR技术分别扩增锌指结构基因(ZFY/ZFX)片段和Y染色体性别决定区基因(SRY)片段,并建立双重PCR扩增方法。结果雄性棕背扩增出ZFY/ZFX和SRY两个基因片段,而雌性棕背只扩增出ZFY/ZFX基因片段。利用这种方法对23只棕背、10只Wistar大鼠和8只BALB/c小鼠进行性别鉴定,扩增结果与表型判断和解剖结果一致。结论以被毛为实验材料,减少了对棕背的惊吓和损伤;建立的双重PCR扩增方法准确、快速,可应用于鼠的性别鉴定。