日本结缕草ZjERF2基因的克隆、转录激活活性、亚细胞定位和表达分析

采用RACE的方法,克隆了日本结缕草(Zoysia japonica)ZjERF2基因(GenBank登录号为MH479420)。其开放阅读框为825 bp,编码274个氨基酸,含有一个高度保守的AP2结构域,具有典型的ERF转录因子特征。遗传进化分析表明其与黍(Panicum hallii)ERF亲缘关系最近。利用染色体步移的方法克隆ATG上游1 549 bp的启动子序列,PLACE预测其含有多个响应激素和胁迫处理的作用元件。构建了pGBKT7-ZjERF2载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,结果表明其具有较强的转录激活活性。为探析其亚细胞定位情况,成功构建35S??ZjERF2?YFP载体,本生烟草(Nicotiana tabacum)瞬时表达结果证明ZjERF2定位于细胞核。利用实时荧光定量的方法分析了ZjERF2的表达特征,结果表明ZjERF2基因在日本结缕草不同部位及不同发育时期表达量均有差异,在成熟叶片表达量最高。此外ZjERF2表达受ET、MeJA的诱导,但受ABA、PEG和NaCl的抑制。本研究表明ZjERF2是一个参与多种信号转导途径的转录因子。

日本结缕草ZjERF2转录激活验证及互作蛋白的初步筛选

为了研究ZjERF2转录因子在日本结缕草(Zoysia japonica)生长发育和环境胁迫中的调控通路,筛选与ZjERF2转录调控过程中互作的蛋白。本研究采用酵母双杂的方法,通过构建“诱饵”载体pGBKT7-ZjERF2,并转化酵母感受态细胞,表明“诱饵”载体在酵母细胞中无毒且不能自激活。将pGBKT7-ZjERF2和日本结缕草全长cDNA文库共转化酵母感受态细胞,经SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培养基筛选获得29个菌落,通过PCR扩增获得23个条带,进一步筛选到18个与ZjERF2互作的候选蛋白。对候选蛋白进行生物信息学分析,初步筛选到5个参与植物的生长发育、抗病原菌及环境胁迫调节的互作蛋白。本研究为探索ZjERF2在植物生长发育和环境胁迫应答的调控机制提供帮助。

枣转录因子ERF 3′端序列克隆及生物信息学分析

以枣为试材,根据GenBank中登录的苹果、拟南芥等植物EFR保守序列设计引物,采用同源克隆法克隆出该基因3′端序列并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析。结果表明:该试验克隆获得1条长度为959bp的条带;经过序列分析,该序列包含典型的AP2/EREBP保守结构域,与桑树、欧洲山毛榉和欧洲栗ERF基因序列相似度分别为79%、78%、77%;系统进化树分析显示,枣的ZjERF与可可树、陆地棉和海岛棉的AP2/EREBP亲缘关系较近,属于ERF家族的B2亚群;此外,还用Swiss Model程序(http://au.expasy.org/tools/)预测了ZjERF基因编码蛋白的三维结构。