玉米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的筛选

为阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用SMART技术反转录合成ds cDNA,构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文库;依据ZmCEN基因的CDS序列设计引物,构建重组诱饵载体(pGBKT7-ZmCEN)转化酵母菌株Y2HGold,检测诱饵载体的毒性与自激活能力后,筛选与玉米中心蛋白(ZmCEN)互作的猎物蛋白。将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b(TON1b)再次验证相互作用,并选取互作蛋白TON1b,采用BiFC实验分别构建ZmCEN-pSPYNE和TON1b-pSPYCE BiFC半分子重组载体,转化拟南芥原生质体,进一步验证它们在细胞内的互作;并利用Uniprot和KEGG在线网站对互作蛋白进行gene ontology(GO)注释分析。结果表明:玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×107 CFU,文库滴度5.36×108 CFU/mL,符合建库要求。经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能,所筛选的cDNA文库经测序和Blast比对分析以及共转验证,最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。GO注释显示互作蛋白参与的生物过程有21种。BiFC结果显示,蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补,从而产生黄色荧光,进一步证实了两者存在互作关系。酵母双杂交系统cDNA文库的成功构建与筛选,为进一步研究玉米ZmCEN及其与互作蛋白的作用机制奠定了基础。

玉米Zmcen基因的克隆、表达与生物信息学分析

为研究玉米Zmcen基因的特征及生物学功能,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米c DNA为模板,将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体p GEX-6p-1中,构建的重组载体p GEX-6p-ZmCen转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过0.3 mmol/L IPTG在27℃下诱导表达20 h,获得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经12%SDS-PAGE电泳和GST标签抗体Western Blotting检测,鉴定为含有GST-Tag的融合蛋白,纯化的蛋白经Pre Scission Protease(PPase)过夜酶切切除GST标签,得到较纯的ZmCen蛋白;同时利用生物信息学的方法,解析ZmCen蛋白质的结构特征。结果表明,该基因定位于玉米第7#染色体上,全长基因含有6个外显子和7个内含子,519 bp的开放阅读框,编码172个氨基酸,分子量约为19.78 k Da,等电点为4.78。采用maize GDB数据库对玉米整个生命周期的表达水平进行分析表明,细胞分裂旺盛的部位,Zmcen基因的表达量较高。对16种植物进行系统发育树分析显示,Zmcen基因与水稻、小麦、拟南芥等的centrin基因同源性高达80.21%,该结果为探索Zmcen蛋白的未知生物学功能提供了线索。

玉米(zea mays.L)ZmCen基因原核表达载体的构建及表达体系的优化

以玉米(zea mays L.)cDNA为模板,并将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体pGEX-6p-1中,构建的重组载体pGEX-6p-Zmc e n转化至大肠杆菌BL21(DE3)。为表达出较大量的可溶性GST-Zm Cen融合蛋白,设置0.1 mmol/L,0.3 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG3种不同浓度,诱导温度和4h、16h和20h的诱导时间建立正交体系,诱导产物经超声波裂解破碎细胞后,通过12%SDS-PAGE比较分析融合蛋白表达量,从而确定最佳的表达体系。结果显示:当诱导温度28℃,IPTG浓度为0.3mmol/L,诱导20 h时可以获得较大量的45kD可溶性融合蛋白(GST-Zm Cen)表达量。

利用CRISPR/Cas9鉴定玉米发育相关基因ZmCen

目的:利用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系统构建玉米中心蛋白(Centrin)的表达载体,经转化后分析其对玉米生长发育的影响。方法:针对ZmCen基因的第一个外显子设计sgRNA,将其连入pOMS01-Cas9-ZmCensgRNA表达载体,转化农杆菌GV3101后,侵染玉米自交系材料B104的愈伤组织,经继代、诱导、分化成苗,筛选出转基因后代。对T0代和T1代基因组DNA进行PCR验证、测序及表型分析。结果:成功构建ZmCen的表达载体。侵染农杆菌后,PCR测序显示,T0代和T1代突变率分别为20.13%和64.52%,其中T1代的纯合缺失突变率为5%。序列分析表明,ZmCen基因的编辑靶点附近发生了碱基的替换、插入或缺失。经与野生型表型比对发现,ZmCen突变体T1代植株出现发育缓慢且雄花序不完全发育表型,纯合突变体植株雄花序则完全不发育。结论:通过CRISPR/Cas9技术成功地对玉米ZmCen基因进行了编辑,ZmCen突变体的获得为玉米雄性器官发育相关基因的研究奠定了基础。