玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化

以玉米B73黄化苗叶片为研究材料,采用酶解法分离并获得高活性的玉米叶肉原生质体细胞,优化PEG-Ca^(2+)介导的玉米叶肉原生质体细胞转化条件,探索电击介导玉米叶肉原生质体细胞瞬时转化方法。同时,以荧光蛋白为报告分子融合细胞器定位信号,建立玉米叶肉原生质体亚细胞定位系统,进一步验证该瞬时表达系统具备可用于基因功能研究的可能性。结果表明,通过酶解法分离获得的玉米叶肉原生质体细胞经过FDA染色统计发现,95%的细胞结构完整且活力较高。在PEG-Ca^(2+)介导瞬时转化方法中,当PEG浓度40%且质粒量增加至25μg时转化效率达到最高,为51.28%。在电击介导瞬时转化方法中,当电压为350 V且电击时间为5 ms的条件下电击转化效率最高,为32.66%。通过将核定位信号NLS与eGFP基因融合转入玉米叶肉原生质体细胞,eGFP成功定位于细胞核。通过将叶绿体定位基因ZmMSH1与DsRed2基因融合并转入,DsRed2蛋白成功定位于叶绿体中。在玉米叶肉原生质体细胞中过表达ZmDHDPS基因,通过qRT-PCR和Western Blot等技术确定了ZmDHDPS高表达活性,并显著提高原生质体细胞内游离赖氨酸含量。