通过荧光标记的凝胶阻滞技术分析Opaque2蛋白与ZmGRAS11启动子的结合位点

凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)是研究蛋白质与核酸结合的一种关键实验技术。EMSA技术兴起以来,使用放射性同位素、生物素标记核酸探针的手段已经非常成熟,但这两种传统的标记技术分别具有放射性探针稳定性差和生物素检测步骤复杂等缺点。近年来,尽管荧光标记探针逐渐被应用于EMSA中,但是对于利用荧光标记探针的EMSA仍缺乏系统的报道。对荧光标记的EMSA技术流程进行了优化和系统总结;利用6-羧基荧光素(6-carboxy-fluoroscine,FAM)标记ZmGRAS11启动子探针,通过EMSA检测其与Opaque2蛋白的结合,明确了蛋白和探针的适宜比例为8∶1。对GCN4 motif序列碱基进行突变并利用EMSA分析Opaque2与ZmGRAS11启动子之间的结合位点,结果表明GCN4 motif的“TGAC”核心基序在ZmGRAS11启动子与Opaque2蛋白的结合中可能起到了关键作用。研究结果为进一步探究Opaque2-ZmGRAS11转录调控模块在玉米籽粒发育中的作用机理提供了数据支撑。

山葡萄基因VaEXO11及其启动子的克隆与序列分析

【目的】探究欧洲葡萄基因VvEXO11在山葡萄中的同源基因VaEXO11的表达及功能,为揭示葡萄抗寒分子通路、培育新的抗寒葡萄品种提供理论依据。【方法】克隆并分析VaEXO11及其启动子PVaEXO11序列,通过瞬时转化烟草探究PVaEXO11与低温胁迫的关系。【结果】从VaEXO11克隆到的cDNA序列全长为957 bp,其中ORF为957 bp,编码318个氨基酸。该基因仅由1个外显子构成,其蛋白含有一个高度保守的Phi_1结构域和一个信号肽,丝氨酸含量丰富,经预测为疏水脂溶性蛋白。对克隆到的P_(VaEXO11)进行顺式作用元件预测,分析结果表明,PVa EXO11不仅含有CAAT-box、TATA-box等核心启动子元件,还具备参与干旱胁迫、昼夜节律调控和创伤响应等功能响应元件。瞬时转化结果表明,低温激活P_(VaEXO11)的活性,VaEXO11的相对表达量迅速上升,直接或间接促进细胞内抗氧化酶的产生。【结论】VaEXO11除了参与低温调控,还可能参与多种逆境相关的调控,从而响应多种生物与非生物胁迫。

人PRR11启动子的结构与功能初步分析

PRR11(proline-rich protein 11,PRR11)是我们最近发现的一个新的肿瘤相关基因.初步研究表明,PRR11参与细胞增殖、细胞周期和细胞癌变等多种生物学过程.为了进一步研究PRR11基因的转录调控机制并全面解析其功能,本研究对PRR11基因的启动子进行了克隆鉴定和初步分析.首先,应用5'RACE(rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增)技术鉴定了PRR11基因的转录起始位点,发现了其具有多个转录起始位点.通过PCR定向克隆和DNA blunting技术,构建了6个相互重叠并覆盖PRR11基因转录起始位点附近约2.0 kb区域的PRR 11基因启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,PRR 11基因启动子主要定位于转录起始位点附近-563 bp～+341 bp的区域内.采用转录因子结合位点预测分析软件分析表明,PRR 11基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有典型的GC盒、CCAAT盒以及潜在的经典转录因子E2F1和MYB的结合位点,提示Sp1、NF-Y、E2F1和MYB等经典转录因子可能参与PRR 11基因的转录调控.

启动子p7.5/p11在山羊痘病毒和羊口疮病毒中的启动功能验证

为验证痘苗病毒启动子p7.5/p11在山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORFV)中的启动功能,本研究通过p TKpp质粒以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒p TKp-gpt-i-GFP-p和p TKpp-H-i-GFP,将其利用脂质体转染预感染GPV或ORFV的羔羊睾丸(LT)细胞中。结果显示,两种重组质粒转染LT细胞24 h后均可以检测到绿色荧光,表明p7.5/p11均能够有效的启动目的蛋白的瞬时表达。同时,构建用于GPV重组的通用转移载体p TKfpgigp,将含有小反刍兽疫病毒(PPRV)的F基因的重组质粒p TKfpgigp-F与GPV共转染LT细胞,经同源重组制备表达PPRV F基因的重组GPV(r GPV)。结果显示,r GPV在感染的LT细胞中F基因能够稳定表达。结果证明,痘苗病毒启动子p7.5和p11均能够被GPV或ORFV编码的RNA聚合酶所识别,从而启动外源目的基因的表达。因此,p7.5和p11可以用于表达外源基因的GPV或ORFV重组病毒的构建。

新疆3个不同品种牛SLC11A1基因启动子克隆及序列分析

【目的】溶质性载体蛋白家族成员l(SLC11A1)基因是一个主要的自然抗性候选基因,与多种胞内寄生病原菌的抵抗作用相关,研究克隆新疆褐牛、荷斯坦牛和西门塔尔牛SLC11A1基因启动子序列,分析启动子序列差异,为奶牛抗病育种提供辅助选择的分子标记。【方法】分别采集新疆3个品种牛全血,提取基因组DNA,PCR扩增5ˊ端启动子区,测序。利用生物信息学软件Cp Gplot、Repeat Masker、TFSEARCH、WWW Signal Scan及双荧光素酶检测系统对获得序列进行分析。【结果】获得SLC11A1基因启动子片段1 463 bp,且具有启动子活性,未发现Cp G岛的存在。新疆3个品种牛间SLC11A1基因启动子序列未出现差异,但与美国安格斯牛SLC11A1基因启动子序列存在4处差异。启动子区预测到SP1,NF1,Rel A-p65,GKLF,CPBP等12个转录因子结合位点,并发现1个增强子区域(-734^-740),该序列存在两处短散的重复元件BOV-t A2、MIR3,以及重复DNA元件Charlie8。【结论】得到新疆地区3个品种牛SLC11A1基因启动子序列,并与安格斯牛SLC11A1基因启动子序列存在差异,为进一步研究SLC11A1基因多态性影响机体对胞内感染菌的抗性研究提供理论依据。

番茄果实特异性启动子2A11的基因克隆及功能研究

采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因(GenBankIDM87659,1993)序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。研究结果表明成功地获得2A11果实特异性启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的基础。

人STK11基因启动子区域的克隆

通过生物信息学分析,预测人STK11基因可能的转录起始位点和重要的调控区域．以此为基础,构建含人STK11基因上游序列缺失片段的pGL3重组载体,瞬时转染L-02和HeLa两种细胞系,通过检测荧光素活性分析缺失片段的启动活性．结果显示各缺失片段在两株细胞中均有启动活性;当3′端固定在-918时,5′端由-1943——1425的移位对启动活性无明显影响,提示这一区间内不存在重要的顺式作用元件;将5′端固定在—1943时,随着3′端向5′的缩短(—918→—1039→—1160),启动活性明显增强(活性pGL3-1943A>pGL3-1943B>pGL3-1943C),提示—1160——1039和—1039——918的区间分别存在负性顺式作用元件,同时提示核心启动子的3′端位于—1160的5′末端．在pGL3-1322(—1322——918)亦观察到启动活性,提示核心启动子的5′端应该位于—1322的3′末端．因此,人STK11基因的核心启动子位于—1322——1160之间．

t(6;11)染色体易位肾细胞癌中Alpha基因片段的克隆及启动子活性分析

目的：构建包含不同Alpha基因片段的重组报告质粒和Alpha1-TFEB融合基因表达质粒,并评价Alpha基因启动子活性。方法：利用软件对Alpha基因进行启动子预测;采用PCR技术扩增出5种不同长度的Alpha基因片段和正常TFEB基因启动子序列pTFEB,构建含Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒;采用脂质体转染法将其分别转染至人胚肾293T细胞;通过荧光素酶活性检测确定Alpha基因的启动子活性。同时构建含Alpha1-TFEB融合基因表达质粒,转染293T细胞后,采用Western blot法检测转染前后TFEB蛋白的表达水平。结果：成功构建含不同Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒。与pGL3-Basic质粒转染组进行比较,Alpha1、Alpha2、Alpha3、Alpha4、Alpha5质粒转染组的荧光素酶活性显著增高（P〈0.01）;与正常TFEB基因启动子进行比较,Alpha1、Alpha2、Alpha5的荧光素酶活性明显增高（P〈0.01）;与pGL3-Enhancer质粒转染组进行比较,pGL3-Enhanc-er-Alpha1-TFEB表达质粒组TFEB蛋白的表达明显升高。结论：t（6;11）染色体易位肾细胞癌中Alpha基因具有启动子活性,可促进TFEB表达,Alpha5片段最强活性区域位于643~693位碱基序列。

11β-类固醇脱氢酶-2启动子区甲基化与原发性高血压关系初探

目的通过11β-类固醇脱氢酶-2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2,11β-HSD-2)基因启动子区甲基化发生率的测定,探讨原发性高血压可能的发病机制。方法选取未经治疗的原发性高血压患者64例以及正常对照组30例,Sequenom MassArray质谱法检测11β-HSD-2基因启动子区"-101到461"的563个碱基序列的甲基化发生率。结果原发性高血压组甲基化发生率高且差异有统计学意义,CpG位点如下:CpG_7、8、CpG_9、CpG_62、63、64、CpG_65、CpG_72。t值分别为-5.42,-3.17,-2.84,-2.32和-2.32,P<0.05。CpG_7、8、CpG_9位于核心启动子区。结论原发性高血压患者11β-HSD-2基因启动子区存在高甲基化发生率位点。

蒙古羊GDF11基因启动子区克隆及序列分析

为了研究生长分化因子11(growth differentiation factor,GDF11)基因与蒙古羊多脊椎性状间的关系,本研究首先克隆了该基因启动子区序列,并采用相关生物信息学软件对该序列进行了分析。结果得到512bp的蒙古羊GDF11基因启动子区序列,整个序列碱基构成为A占10.55%,G占16.80%,T占31.84%,C占40.82%,整个序列G+C含量百分比为57.62%。通过在线软件对蒙古羊GDF11基因启动子区生物信息学分析结果表明,该区域未找到符合条件的CpG岛,也未发现TATA box或CAAT box结构,但存在一处潜在的转录起始位点和HSF2、HSF2、GATA-1、AML-1a和MZF1 5个潜在转录因子,并且具有5种基序结构:EGF_1、CTCK_1、ANAPHYLATOXIN_1、VWFC_1和DEFENSIN。本研究结果为进一步揭示该基因对蒙古羊脊椎数的调控机理提供了重要的理论依据。

大豆11S球蛋白基因Gy1启动子克隆及序列分析

以高蛋白大豆品种南农87C-38总DNA为模板,采用PCR法扩增获得约1100bp大小的DNA片段,回收该片段并克隆到pUCm-T载体上,选取阳性克隆进行PCR和酶切检测,再进行测序分析.序列分析显示该片段含1174个核苷酸,采用Vector NTI软件将试验中克隆的序列与GenBank E07850报道的Gy1启动子和GenBank X15121报道的Gy1启动子及信号肽对应序列分别进行比对,同源性分别为99.6%和99.3%,确定该片断为南农87C-38大豆11S球蛋白基因Gy1启动子及信号肽.该启动子的成功克隆,可为今后利用基因工程技术改良大豆种子营养品质研究奠定基础.

Peutz-Jeghers综合征患者中STK11基因启动子区序列多态性分析

目的:探讨STK11基因启动子-1543～-1160区域序列变化与Peutz-Jeghers综合征(PJS)的关系。方法:采用PCR产物直接测序的方法,对15例PJS患者和42例正常个体的STK11基因启动子区进行序列分析。结果:发现STK11基因启动子区的1个新的单核苷酸多态性(SNP)位点(-1275)G/T;该位点GG,GT,TT这3种基因型在患者和正常对照者中的频率分布分别为53.3%,26.7%,20%和33.3%,64.3%,2.4%,PJS患者组GG基因型和TT基因型频率均高于正常对照组,而GT基因型低于正常对照组,差异有统计学意义(χ2=8.521,P<0.05)。结论:STK11基因(-1275)G/T是1个新的SNP,该SNP基因型与PJS发生的关系有待进一步研究。

人细胞色素P450 4A11基因核心启动子区的鉴定

目的研究细胞色素P450 4A11基因启动子区对该基因转录活性的影响。方法运用生物信息学的方法预测细胞色素P450 4A11基因启动子区的重要调控序列,然后采用5’侧翼区缺失的方法将包含重要调控序列的启动子克隆到双报告基因载体中,用脂质体转染HepG2细胞,24h后检测荧光素酶相对活性。然后使用Alibaba2.0 Transfac4.0预测增强子区域可能存在的转录因子结合位点。结果·36～-720～+1、-972～+1、-1039～+1区域的启动子活性较高,其中-972～+1区域最强,与此相比-536～+1、-720～+1荧光素酶相对活性分别下降了96.9%和70.1%。结论人CYP4A11基因5’侧翼区的影响转录活性的启动子关键区域位于-972～-720bp范围内。

糖皮质激素诱导A549细胞11β-羟基类固醇脱氢酶1型选择性启动子的使用

目的探讨糖皮质激素诱导11β-羟基类固醇脱氢酶1型表达,其选择性启动子的使用情况,为进一步研究糖皮质激素诱导的HSD11B1表达情况和基因的转录调控模式奠定基础。方法糖皮质激素皮质醇(100 nM)和地塞米松(100 nM)预先处理A549细胞,通过半定量-RT-PCR和荧光报告基因检测方法,检测A549细胞中HSD11B1 mRNA表达水平和报告基因蛋白表达水平。结果半定量-RT-PCR结果显示A549细胞中HSD11B1mRNA表达显著增加经由P1和P2两个启动子,但HSD11B1 mRNA表达主要来自于P2;荧光报告基因表达结果显示A549细胞中糖皮质激素诱导的P2荧光报告载体相对荧光活性显著增加,然而P1荧光报告载体相对荧光活性没有明显变化。结论糖皮质激素诱导A549细胞HSD11B1表达经由选择性启动子P2。

猪CYP11A1基因编码区扩增及核心启动子区的鉴定与分析

[目的]本文旨在扩增猪CYP 11A1基因编码区,鉴定并分析其核心启动子区,探究猪CYP 11A1基因的转录调控机制。[方法]通过基因克隆测序技术获得猪CYP 11A1基因编码区全序列并对其序列特征进行分析;利用荧光素酶活性鉴定猪CYP 11A1基因核心启动子区,再通过生物信息学分析猪CYP 11A1基因核心启动子区潜在的甲基化位点与转录因子结合位点;利用Western blot、RT-qPCR以及染色质免疫沉淀(ChIP)等分子生物学手段解析转录因子NR2C1对猪CYP 11A1基因的转录调控功能。[结果]猪CYP 11A1基因的编码区序列全长为1563 bp,在哺乳动物的进化过程中高度保守;猪CYP 11A1基因的核心启动子区为-398~-108 bp(转录起始位点为+1),序列特征分析发现猪CYP 11A1基因核心启动子区包含多个潜在的转录因子的结合元件,包括NR2C1、SOX10、NFIX和ELF5等;另外,转录因子NR2C1可促进猪CYP 11A1基因核心启动子区活性,同时显著上调体外培养的猪卵巢颗粒细胞中CYP 11A1基因的表达。[结论]哺乳动物CYP 11A1基因在进化过程中高度保守,转录因子NR2C1能够促进猪卵巢颗粒细胞中CYP 11A1基因的转录。

奶牛CCL11基因启动子、外显子的扩增及多态性分析

为了探讨CCL11基因启动子和外显子的多态性,试验采集88头中国荷斯坦奶牛的血液样品,通过PCR技术扩增了中国荷斯坦奶牛CCL11基因外显子和启动子序列,同时用限制性内切酶酶切的方法检测了中国荷斯坦奶牛CCL11基因外显子的多态性,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳判断突变位点的基因型,通过ESEfinder 3.0在线软件预测差异位点基因序列可能存在的ESE基序,利用Expasy-Translate tool在线翻译软件将基因测序结果翻译成氨基酸序列。结果表明:试验成功扩增出中国荷斯坦奶牛CCL11基因启动子序列,第1段长度为794 bp,第2段长度为1060 bp,经测序未检测出多态位点,3个外显子序列长度分别为524,539,1130 bp,其中第2,3外显子经测序未检测出多态位点。在第1外显子80 bp处存在一个T>G的突变,且突变导致氨基酸序列由缬氨酸变为甘氨酸,为有义突变,突变与ESE基序之间存在着较强的相关性。CCL11基因有TT(野生型)、TG(杂合型)、GG(突变型)3种基因型,基因型频率分别为17.05%、75.00%和7.95%。说明奶牛CCL11基因的突变可能与奶牛乳腺炎的发生相关。

中国多囊卵巢综合征妇女CYP11a基因启动子的微卫星多态现象(ttta)

A (tttta)n microsatellite polymorphism in the promoter of CYP11a gene was investigated in 201 Chinese Han women with polycystic ovary syndrome (PCOS) and 147 control women. The 6/6 genotype was defined with significant difference of CYP11a polymorphism between women with PCOS and control women, and associated with greater BMI in PCOS patients, suggesting a certain role of the six-repeat allele variant in the pathogenesis of Chinese women with PCOS.

果实特异性启动子驱动的含sbr基因植物高效表达载体的构建

目的构建果实特异性启动子驱动的含编码变形链球菌唾液粘附区(sbr)植物表达载体,进一步提高外源目的基因的表达,为研制有效的转基因植物防龋疫苗打下基础。方法提取番茄基因DNA,利用PCR技术扩增果实特异性启动子E8和2A11基因,双酶切质粒PROP及PROSC,分别与目的基因连接,构建重组植物表达载体。结果通过双酶切鉴定,目的基因片段已正确整合到植物表达载体中。结论本实验成功构建了果实特异性启动子驱动的含sbr基因的植物表达载体。

甘蔗ScHAK11基因启动子的克隆与初步分析

钾转运体ScHAK11基因是甘蔗钾转运体基因家族的重要成员。本研究以甘蔗为材料,通过染色体步移方法对ScHAK11上游启动子片段(pScHAK11)进行克隆,获得ScHAK11起始密码子ATG上游启动子序列,序列长度为2018 bp。序列分析表明,该序列包含多个真核生物启动子核心元件TATA-box、CAAT-box以及与逆境胁迫、光响应、激素诱导、分生组织和叶肉栅栏组织表达等顺式作用元件,推测pScHAK11启动子受到多种激素和逆境胁迫诱导表达,并通过分生组织和叶肉栅栏组织等顺式调控元件参与对甘蔗组织发育的调控。将p ScHAK11启动子序列与包含GUS基因的载体pBI121连接进行活性分析,发现pScHAK11启动子片段能驱动GUS基因在烟草茎和根中瞬时表达。荧光定量PCR结果表明,ScHAK11主要在甘蔗叶片和根系表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pScHAK11启动子驱动的GUS基因在烟草中的表达结果不一致,结果表明p Sc HAK11启动子是组织特异型启动子。本研究结果有助于深入了解ScHAK11基因表达调控的分子机制,为研究ScHAK11基因的转录调控机制奠定基础。

人肝再生增强因子下调钙结合蛋白S100A11基因表达的研究

目的探讨人肝再生增强因子(ALR)对钙结合蛋白S100A11启动子(S100A11p)转录的调节作用。方法利用生物信息学技术确定S100A11p区域,聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11p,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3S100A11p报告载体;以该质粒转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,并以人ALR的真核表达载体pcDNA3.1(-)ALR共转染的HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测CAT的表达活性。结果pCAT3S100A11p在HepG2细胞中具有CAT的表达活性;以pcDNA3.1(-)ALR和pCAT3S100A11p共转染HepG2细胞,CAT表达活性是单独转染细胞组pCAT3S100A11p的0.42倍。结论所克隆的S100A11启动子有启动子的转录活性,ALR的转基冈表达具有对S100A11基因的下调作用。