玉米ZmcpSRP54基因可变剪接分析

cpSRP54基因在植物叶绿体发育中发挥重要作用。本研究用生物信息学方法对玉米ZmcpSRP54蛋白进行了进化分析,利用RT-PCR方法对玉米ZmcpSRP54基因全长cDNA进行了克隆,进而对其进行可变剪接分析。结果表明,玉米ZmcpSRP54蛋白与其它7个物种的cpSRP54蛋白有很高的相似性。鉴定到玉米ZmcpSRP54基因25个不同转录本,1个为标准剪接转录本,其它24个为可变剪接转录本。24个可变剪接转录本共使用了17种非标准剪接位点,4种可变剪接方式,主要以可变的3′端位点、可变的5′端位点和外显子跳跃3种可变剪接方式为主。预测出18种不同长度的ORF,编码18种不同长度的多肽。11个多肽其保守结构域氨基酸序列发生部分缺失,6个多肽其保守结构域氨基酸序列发生全部缺失,1个编码全新的多肽。这些结果将为玉米ZmcpSRP54基因的功能研究提供重要信息。

KISS-1/GPR54基因及其在生殖中的作用

KISS-1及其受体GPR54基因对青春期的正常启动具有重要作用。青春期开始前后,动物下丘脑中KISS-1和GPR54 mRNA水平很高,Kisspeptins(KISS-1基因产物)通过激活GPR54增加促性腺激素的释放,KISS-1基因的表达受性腺类固醇激素的调控。GPR54基因突变可以导致人和鼠的特发性促性腺激素分泌不足性腺机能减退症和促性腺激素依赖性性早熟。文章还介绍了KISS-1、GPR54基因的结构、表达、多态性以及和其它生殖调控因子之间的相互关系。

非洲猪瘟病毒p54基因的原核表达及其抗体的间接ELISA检测方法的建立

将非洲猪瘟病毒P54基因克隆到原核表达载体pET-52b(+)3C/LIC中,转入BL21(DE3)菌中诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析的结果表明,表达蛋p54的分子质量约为28ku,具有很好的抗原性。纯化p54蛋白后,采用2.5μg/mL浓度作包被抗原,建立了检测非洲猪瘟p54抗体的间接ELISA方法,结果表明建立的间接ELISA方法特异性、敏感性都较好。

伪狂犬病病毒Ea株UL54基因的克隆与序列分析

根据伪狂犬病病毒国外Ka株UL5 4基因核苷酸序列 ,设计一对包含UL5 4基因完整编码区的引物 ,以伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株细胞感染物为模板 ,PCR扩增出大小约 1.1kb特异性带。将纯化的扩增产物克隆到pBluescriptⅡsk +中 ,酶切分析证实后经双脱氧末端终止法进行全序列测定 ,序列分析结果表明Ea株UL5 4基因全长 10 86bp ,可编码 36 1个氨基酸。由二级结构预测数据推断C 末端具有典型的锌指结构域。运用Blast软件与Ka株UL5 4基因进行同源比较 ,发现Ea株UL5 4基因在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处点突变 ,但无插入或缺失突变 ;将Ea株UL5 4氨基酸序列同其它 4种α 疱疹病毒 (HSV 1、HSV 2、VZV、EHV 1)进行同源比较 ,同源性分别为 47%、36 %、36 %和 44 %。

非洲猪瘟病毒P54基因原核表达载体的构建与表达

根据GenBank中非洲猪瘟病毒(ASFV)P54基因序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法从ASFV DNA中分别扩增出了P54基因片段和经过改造的跨膜信号肽缺失的P54基因,将其克隆到表达载体pET28b中,构建了重组质粒pET-P54和pET-P54q,测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE,Western-blotting检测。结果显示,经过改造的信号肽缺失的重组菌pET-P54q可表达出分子质量约24.5 ku的重组融合蛋白,表达的蛋白以可溶形式存在于菌体中,经镍柱亲和层析纯化可获得纯度较高的目的蛋白。纯化的蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,证实,表达的蛋白具有较好的反应原性。

广东地区汉族人MBL基因GGC54GAC点突变的初步筛查

目的 对广东地区汉族人群的甘露聚糖结合凝集素结构基因第一外显子第 5 4位密码点突变 (GGC5 4GAC)进行初步筛查。方法 提取外周血白细胞DNA进行相应片段的PCR扩增 ,再对产物进行单链构象多态性分析。结果 在 16 6人中查出野生型纯合子 14 7例 ,占 88.5 5 % ,GGC5 4GAC突变杂合子 19例 ,占 11.4 5 % ,未发现GGC5 4GAC突变纯合子。结论 广东地区汉族人群MBL基因GGC5 4GAC突变频率为 0 .0 5 7。

GPR54基因在绵羊不同组织中的表达及其在睾丸中的定位研究

试验旨在研究GPR54（G-protein coupled receptor54）基因在绵羊不同组织中的表达及其在4～6月龄公羔睾丸组织中的表达特性及定位。本研究采用实时荧光定量PCR法检测各组织GPR54mRNA表达规律，以及其在不同月龄公羔睾丸中的表达量，运用免疫组化技术对睾丸中GPR54基因进行定位分析。结果显示，GPR54在不同组织中均有不同程度的表达，其中在下丘脑、垂体和睾丸中大量表达；GPR54在4～6月龄绵羊公羔睾丸组织中呈阶段性表达，6月龄表达量显著高于4和5月龄（P〈0．05）；4月龄时，在精原细胞和极少数的初级精母细胞中检测到较弱的阳性信号；6月龄性成熟时，在睾丸中分裂早期的精子细胞检测到强阳性信号。综上表明，GPR54基因在绵羊不同组织中广泛表达，在下丘脑一垂体一睾丸生殖轴中发挥重要的作用，并与动物的性成熟及雄性动物精子发生过程有密切的关系。

北方汉、回、蒙三民族健康人群MBL54,52,57位密码子基因多态性

目的初步调查我国北方地区健康汉、回、蒙族人群MBL基因ExonⅠ54,52,57位密码子点突变的情况。方法用PCR-RFLP方法检测MBL54,57位密码子基因点突变频率;用PCR-SSP方法检测MBL52位密码子基因点突变频率。结果测得MBL54位密码子基因突变频率:汉族0.20;回族0.15;蒙古族0.17。52位密码子基因突变频率:汉族0.03;回族0;蒙古族0。57位密码子基因突变频率:汉族0.10;回族0.03;蒙古族0。结论健康汉、回、蒙族人MBL基因54位密码子点突变频率差异无显著性(Х2=3.31,P>0.1);52位密码子点突变频率差异有显著性(Х2=12.37,P<0.005);57位密码子点突变频率差异有显著性(Х2=27.83,P<0.005)。

G蛋白偶联受体54基因在骨肉瘤中的表达及其临床意义

目的:研究G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPR)54基因的表达与骨肉瘤生物学行为和临床预后的关系。方法:应用RT-PCR检测3种人骨肉瘤细胞(MG-63、Saos-2、U-2 OS细胞)和正常人成骨hF-OB1.19细胞中GPR54 mRNA的表达情况,免疫组织化学技术检测44例骨肉瘤和12例骨软骨瘤组织中GPR54蛋白的表达情况,应用Transwell侵袭实验比较不同骨肉瘤细胞的侵袭、迁移能力。结果:在人骨肉瘤MG-63、Saos-2、U-2 OS细胞和正常人成骨hF-OB1.19细胞中,GPR54mRNA表达水平均较高,各组细胞间差别无统计学意义[(0.87±0.05)、(0.88±0.07)、(0.88±0.08)、(0.86±0.05),P>0.05]。骨肉瘤MG-63、Saos-2、U-2 OS细胞侵袭、迁移细胞数逐渐降低[(61.00±7.15)vs(32.40±5.36)、(18.10±3.21)个,P<0.05或P<0.01]。人骨肉瘤组织中GPR54蛋白表达阳性率显著高于骨软骨瘤组织(81.82%vs 41.67%,P<0.05)。GPR54蛋白阳性表达的骨肉瘤患者平均生存期明显短于GPR54蛋白阴性表达的患者[(27.39±6.05)vs(40.33±4.88)月,P<0.05]。结论:GPR54基因在骨肉瘤组织中的表达阳性率增高,且与患者临床生存期呈负相关。

食管鳞状细胞癌C20orf54基因多态性与吸烟、饮酒及体质量指数的相关性研究

目的探讨食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)C20orf54基因多态性rs13042395位点与吸烟、饮酒、体质量指数的相关性。方法选取7 673例患者和11 013例正常者C20orf54基因多态性rs13042395位点基因分型资料(基因分型采用sequenom芯片)。比较各组间基因型和等位基因频率的分布。结果病例组与对照组间C20orf54基因多态性rs13042395位点基因型和等位基因频率分布,差异具有统计学意义(P<0.05),C20orf54T等位基因降低ESCC患病风险(P=1.21E-11,OR=0.86,95%CI=0.82～0.90)。C20orf54基因多态性位点rs13042395在吸烟/不吸烟、饮酒/不饮酒及各级BMI人群中未观察到与ESCC的相关性。结论 C20orf54基因多态性、rs13042395遗传多态性与ESCC的易感性相关,与吸烟、饮酒、体质量指数无明显相关性。

GS介导RNase P对人巨细胞病毒ul54基因mRNA的切割作用

引导序列(Guide Sequences,GSs)是与mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段。设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus,HCMV)ul54基因D片段mRNA序列互补的GS,将其共价结合到大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA,构建成T7-M1GS核酶。通过对ul54基因D片段转录产物体外切割实验和将T7-M1GS构建在含有U6启动子的逆转录病毒载体,与构建在真核载体pEGFP-N1的ul54基因D片段共转染人宫颈癌细胞系HeLa的体内切割实验,证实该核酶具备对ul54基因D片段mRNA的特异切割能力,为利用核酶治疗HCMV感染提供实验基础。

shRNA靶向沉默HSV-2 UL54基因在HEK293细胞内的表达

根据乙型单纯疱疹病毒(HSV-2)UL54基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆至真核表达载体p GPU6/GFP/Neo中,经脂质体介导转染HEK293细胞,倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测HEK293细胞的存活率,RT-PCR检测UL54基因m RNA的表达,Western blot检测UL54基因编码蛋白质的表达,终点滴定法测定细胞上清液中的病毒感染滴度。结果显示,sh RNA1081能抑制UL54基因m RNA和蛋白质的表达,能显著降低子代病毒滴度,提高细胞的存活率。表明本研究构建的重组表达载体p GPU6/GFP/Neo-UL54 sh RNA能在HEK293细胞中表达,并抑制HSV-2复制。

伪狂犬病病毒Ea株UL54基因在BHK-21细胞上的表达

以伪狂犬病病毒Ea株BamHI5’片段为模板 ,PCR扩增出约 1.1kbUL5 4基因完整编码区片段 ,将该基因克隆到pB1uescriptIISK+ 中 ,构建重组载体pSKUL5 4。进一步将该片段插入真核表达载体pEGFP_C1的增强绿荧光蛋白EGFP下游 ,构建真核表达载体pEGFPUL5 4,脂质体法转染BHK_2 1细胞 ,G418加压筛选至正常细胞完全死亡 ,在倒置荧光显微镜下观察 ,可见pEGFPUL5 4和pEGFP_C1均发出较强荧光 ,pEGFP_C1转染的细胞在整个细胞发出荧光 ,而pEGFPUL5 4转染细胞在细胞核中发出很强的荧光 ,证明UL5 4基因在BHK_2 1细胞上获得了表达 。

锌指蛋白A20基因抑制缺氧诱导内皮细胞CD54的表达

【目的】探讨外源性锌指蛋白基因A20对缺氧诱导内皮细胞黏附分子CD54表达的影响。【方法】培养原代人脐静脉内皮细胞,将细胞分组建立缺氧模型;采用DOTAP脂质体介导pcDNA3.1EHA20质粒转染培养的内皮细胞,筛选抗G418的阳性克隆,经免疫荧光鉴定A20基因的表达;采用免疫组化和原位杂交检测内皮细胞CD54的表达。【结果】A20基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到高效表达。缺氧能诱导人内皮细胞CD54高表达,外源性A20基因能抑制75%以上由缺氧诱导的内皮细胞CD54表达,两者间相差明显(P<0.01)。【结论】外源性A20基因能够显著抑制缺氧诱导的内皮细胞活化,有效抑制CD54的表达,可能在内皮细胞缺氧损伤中具有保护作用。

UL54和UL29基因干扰对HSV-2复制的影响

目的利用RNAi技术同时沉默Ⅱ型单纯疱疹病毒的UL54和UL29基因,探讨双基因干扰对HSV-2复制的影响。方法采用pGPU6/GFP/Neo质粒分别构建UL54、UL29基因的shRNA重组表达质粒,单独或同时转染HEK293细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测UL54、UL29基因的表达,终点滴定法检测培养细胞上清液中病毒感染滴度;MTT法测定细胞的存活效率。结果转染后48h后,与空白组相比,各干扰组均可不同程度降低上清液中的病毒滴度,提高细胞存活率,降低目的基因mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。与单干扰组相比,双基因干扰组能更有效降低病毒滴度并提高细胞存活率(P<0.01),增加了对UL54和UL29基因mRNA的抑制率,降低了蛋白的表达(P<0.01)。结论 pGPU6/GFP/Neo-UL54、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达质粒同时转染细胞可抑制HSV-2的复制,采用双基因干扰比单独基因干扰具有更高的效率。

云南烟草花叶病毒54KD基因的分离、克隆及序列分析

从云南省弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝，植斑分离，经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ（Ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ），在红花大金元品种中以ＴＭＶ普通株作对照进行致病力测定，确定为强毒株系。以烟草花叶病毒ＲＮＡ云南强毒株系为模板，根据国内外研究结果自行设计、合成寡核苷酸引物，通过ＲＴ—ＰＣＲ体外扩增，Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α克隆，获得了云南烟草５４ＫＤ（ＴＭＶ复制酶）全基因片段。顺序分析表明：该基因含１４２５个核苷酸，编码４７５个氨基酸，与国外发表的Ｕ１株系比较，ＤＮＡ同源率为９９．０％，氨基酸同源率为９８．９％，与国内普通株比较，ＤＮＡ同源率为９９．１％，氨基酸同源率为９８．９％。

贫困山区早孕期HCMV宫内感染与UL54基因突变的研究

目的:探讨贫困山区早孕期人巨细胞病毒(HCMV)宫内活动性感染与HCMVUL54基因突变的关系。方法:采用免疫组织化学(SABC)PCR-RFLP的方法检测人绒毛组织中HCMV早期抗原的存在及HCMVUL54基因密码子501是否发生突变。结果:贫困山区早孕期妇女HCMV宫内活动性感染率为18.91%;PCR-RFLP分析结果显示,在早孕期HCMV宫内感染者中UL54501密码子未发生突变。结论:贫困山区早孕期HCMV宫内感染与HCMVUL54基因密码子501突变无关,但不排除其他位点的突变或其他形式异常导致病毒致病性改变存在的可能性。

猪发育期NPY-Y1和GPR54受体基因的表达规律研究

[目的]研究猪发育期NPY-Y1和GPR54受体基因的发育性变化。[方法]分别选取初生、60、120、初情期、180日龄的苏姜猪母猪各3头,采集下丘脑、垂体、卵巢组织样品,提取组织RNA,采用荧光定量PCR分析NPY-Y1、GPR54受体基因的发育性变化。[结果]下丘脑、垂体与卵巢内NPY-Y1 mRNA从初生到初情期表达量逐渐下降,在初情期达到最低,初情期后呈上升趋势。在3种组织内,初情期与其他时期NPY-Y1 mRNA表达量均存在显著差异(P<0.05);GPR54 mRNA从初生到初情期表达量逐渐上升,在初情期达到最高,初情期后呈下降趋势。在3种组织内,初情期也与其他时期GPR54 mRNA表达量也均存在显著差异(P<0.05)。[结论]猪发育期NPY-Y1基因与GPR54基因表达存在负相关性。

RNase P核酶对人巨细胞病毒UL54基因mRNA体外切割作用

外部引导序列(EGSs)是mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段。我们设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus) UL54基因mRNA序列互补的EGSs,将其与大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA构建成M1GS核酶。通过对UL54基因亚克隆片转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54 mRNA片段的特异切割能力,可以发展成为一种抗病毒试剂。

shRNA靶向干扰UL27、UL54基因对HSV-2复制的影响

为探讨单纯疱疹病毒-2型(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)UL 27、UL 54基因的重组表达载体shRNA(small hairpin RNA,shRNA)联合干扰对HSV-2复制的影响,将重组质粒表达载体转染HEK293细胞,利用流式细胞术检测重组质粒转染HEK293的效率,实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)方法检测UL 27、UL 54基因及其蛋白的表达情况。此外,采用TICD 50(50%tissue culture infective dose,TCID 50)法和噻唑蓝(methyl thiazolyl terazolium,MTT)比色法检测病毒的滴度变化和HEK293细胞的存活率。结果检测显示:UL27 shRNA75+UL54shRNA1081联合干扰组的UL 27、UL 54基因mRNA的表达抑制率分别为(88.10±1.95)%和(85.53±2.28)%,gB蛋白、ICP27蛋白表达及子代病毒滴度均明显降低,HEK293细胞的存活率为(97.30±2.91)%,与单干扰组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。说明UL27shRNA75和UL54 shRNA1081这两个靶点联合干扰能显著抑制HSV-2在HEK293细胞中复制,为今后的HSV-2多基因的治疗提供研究基础。