稻曲病病菌Zn_(2)(Ⅱ)Cys6型转录因子UvZC1基因的克隆及功能分析

为明确Zn_(2)(Ⅱ)Cys6型转录因子UvZC1在稻曲病病菌中的功能,利用CRISPR-Cas9结合同源片段双交换的方法,诱导野生型菌株Jt209发生UvZC1基因缺失突变。结果显示,与Jt209相比,UvZC1基因缺失突变体的生长速率和分生孢子量均显著下降,且突变体中部分与稻曲病病菌其他产分生孢子相关基因表达量发生变化;此外,该基因的缺失导致突变体对十二烷基硫酸钠(SDS)更敏感,而对氧化胁迫的耐受性增强;在稻曲病病菌接种水稻后24 h、48 h的侵染早期,UvZC1基因的表达量明显上升,但基因缺失突变体接种水稻后形成的稻曲球数量与野生型之间没有差异。综上所述,UvZC1基因参与稻曲病病菌营养生长、分生孢子产生和侵染水稻过程,还与稻曲病病菌细胞壁的完整性和响应氧化胁迫相关。

牛樟芝Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子的全基因组鉴定与分析

为深入了解牛樟芝Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子的功能,利用本地Blast对牛樟芝全基因组的蛋白序列进行全局比对,鉴定出20个牛樟芝Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子蛋白序列。通过生物信息学方法对Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子进行结构和功能预测,并利用转录组测序分析Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子在不同段木培养条件下菌丝体和子实体的表达情况。结果表明:20个Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子均具有Cy6型锌指基序,属于GAL4型锌簇蛋白转录因子,其氨基酸数量为225~1384个;理论等电点平均pI值为6.91,均为不稳定蛋白;其中,AcCys6-17存在跨膜结构;AcCys6-9、AcCys6-14定位在细胞质中;平均每个转录因子含9个外显子,AcCys6-6有25个外显子,二级结构以无规卷曲为主要结构。Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子基因表达在不同段木的菌丝体和子实体存在差异,有11个转录因子在香樟段木菌丝体表达量高,AcCys6-16在香樟段木子实体表达量高;AcCys6-11在牛樟段木菌丝体表达量高;AcCys6-4在云南樟段木菌丝体表达量最高。

Zn(Ⅱ)2Cys6锌指转录因子的结构和功能研究进展

Zn(Ⅱ)2Cys6锌指转录因子,是一类真菌所特有的转录因子。近年来的研究表明,Zn(Ⅱ)2Cys6锌指转录因子主要参与真菌对外界胁迫应答反应、脂类等物质的合成、致病性和次级代谢产物调节过程。但关于Zn(Ⅱ)2Cys6锌指转录因子全面的功能整理鲜有报道。因此本综述从锌指类转录因子的结构和分类出发,对Zn(Ⅱ)2Cys6锌指转录因子进行简述,并重点阐述Zn(Ⅱ)2Cys6锌指转录因子在真菌生长发育过程中主要发挥的各项功能。

血清ATF6、CaMKⅡ表达水平与冠心病及冠状动脉狭窄程度的相关性

目的探讨激活转录因子6(activated transcription factor 6,ATF6)、钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)水平与冠心病及冠状动脉(简称冠脉)狭窄程度的相关性,并研究其对冠心病的预测价值。方法选取接受冠脉造影的265例冠心病患者,并收集其临床资料。根据冠脉造影结果及Gensini评分的中位数(38分),将这些患者分为轻度狭窄组(Gensini评分≤38分,n=105)、中重度狭窄组(Gensini评分>38分,n=100),冠脉造影结果正常者设为对照组(n=60)。观察各组患者的ATF6、CaMKⅡ表达水平并进行统计学分析。结果与对照组相比,轻度狭窄组及中重度狭窄组血清ATF6、CaMKⅡ水平均明显升高,且其水平随着冠脉狭窄程度的加重而上升,差异有统计学意义(P<0.05)。根据Logistic回归分析显示,ATF6、CaMKⅡ可能是冠心病发生的独立危险因素。ROC曲线分析显示,血清ATF6、CaMKⅡ联合预测冠心病的AUC值为0.749(95%CI 0.676~0.822),敏感性为0.663,特异性为0.717,较ATF6、CaMKⅡ单独诊断的价值更高。结论血清ATF6、CaMKⅡ水平与冠脉狭窄程度呈正相关,且ATF6、CaMKⅡ水平对冠心病具有一定的预测价值,有望为诊断冠心病及评估其严重程度提供更多的参考。

STAT6介导白细胞介素-13诱导巨核细胞系HEL细胞血小板膜糖蛋白Ⅱb和血管性血友病因子的表达

目的：探索信号转导子和转录激活因子6（STAT6）介导白细胞介素-13（IL-13）对巨核细胞系-人红白血病HEL细胞（HEL）血小板膜糖蛋白Ⅱb（GPⅡb）和血管性血友病因子（vWF）表达的作用，部分阐明IL-13的信号转导通路。方法：RT-PCR检测GPⅡb和vWF mRNA的表达，免疫印迹法检测磷酸化的STAT6、GPⅡb和vWF蛋白的表达，图像分析检测电泳条带吸光度。结果：IL-13（100μg／L）作用HEL细胞，使HEL细胞STAT6磷酸化，磷酸化抑制剂A77-1726（50μmol／L）阻断了IL-13诱导的HEL细胞STAT6磷酸化。IL-13（100μg／L）上调了HEL细胞GPⅡb和vWF mRNA和蛋白的表达，A77-1726（50μmol／L）抑制了STAT6介导的IL-13诱导HEL细胞GPⅡb和vWF mRNA和蛋白的表达。结论：IL-13上调了HEL细胞GPⅡb和vWF的表达，STAT6介导了IL-13上调HEL细胞GPⅡb和vWF的表达。

木屑处理迷宫栓孔菌Zn(Ⅱ)-Cys(6)转录因子差异表达分析

Zn(Ⅱ)-Cys(6)蛋白是一类仅存在于真菌中的锌指转录因子,其在迷宫栓孔菌(曾用名“偏肿革裥菌”)Trametes gibbosa中的相关研究较少。本研究对木屑处理后的迷宫栓孔菌进行转录组测序分析,以期挖掘到差异表达的Zn(Ⅱ)-Cys(6)转录因子,为后续进一步对其功能的分析提供支持。首先,对在木屑处理下的T.gibbosa木质素降解酶进行了酶活检测,确认迷宫栓孔菌能有效降解木质素。之后,用木屑分别处理迷宫栓孔菌0、3、5、7和11d,提取菌丝总RNA,利用高通量测序技术对这5个菌丝样本进行了转录组测序分析。通过COG、GO、Pfam和Swiss等数据库进行功能注释分析,鉴定出迷宫栓孔菌中全部的Zn(Ⅱ)-Cys(6)家族转录因子基因,并进一步筛选出7个差异表达基因。进一步又对这7个差异基因的表达及蛋白结构进行了分析,绘制表达趋势热图,同时也对其理化性质,二、三级结构,疏水性等生物学特性进行了预测。通过构建系统发育树、预测Motif序列等初步分析了它们的进化关系及特性。最后,对这7个基因又利用RT-qPCR技术,进一步验证了转录组测序的结果。本研究从转录水平分析并鉴定出在木屑处理条件下迷宫栓孔菌中7个差异表达的Zn(Ⅱ)-Cys(6)转录因子,研究结果将对后续研究迷宫栓孔菌中Zn(Ⅱ)-Cys(6)转录因子的功能和表达调控机制有重要的参考价值。

参与丝状真菌次级代谢Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子的生物信息学分析

本研究根据在GenBank中已登录的扩展青霉(Penicillium expansum)中棒曲霉素簇转录因子PePatL、棒曲霉菌(Aspergillus clavatus)中棒曲霉素簇转录因子PatL、构巢曲霉(A. nidulans)中柄曲霉素转录因子AFLR、黄曲霉(A. flavus)中黄曲霉毒素转录因子AFLR、长毛柄孢壳菌(Podospora comata)中黑色素转录因子Cmr1p、轮状镰刀霉菌(Fusarium verticillioides)中富马菌素转录因子Fum21p、烟曲霉菌(As-pergillus fumigatus)中神经胶质毒素转录因子GliZ、紫红曲霉(Monascus purpureus)中橘霉素转录因子CtnR等8个参与丝状真菌次级代谢的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子,应用生物信息学软件预测了其保守结构域、疏水性、蛋白跨膜、亚细胞定位、二级结构、三级结构和蛋白相互作用网络等。结果显示:它们均具有保守区域为CX2CX6CX6CX2CX6C的锌指结构,且N-端都存在保守的GAL4域,富含丝氨酸(Ser),无明显跨膜结构域,无信号肽,为定位于细胞核的亲水性不稳定蛋白,属于非分泌型蛋白。蛋白序列在多个氨基酸位点均存在不同程度的磷酸化,其中丝氨酸发生磷酸化程度相对最高,在不同位置的磷酸化水平也不同。它们的二级结构均主要以无规则卷曲为主,三级结构也较为相似。蛋白相互作用网络预测8个转录因子的活性可以通过与其他全局性转录因子或蛋白间的相互作用进行调节。本研究的结果将为进一步研究丝状真菌次级代谢转录因子在次级代谢产物生物合成过程中的生物学功能提供一定的基础。

桑黄Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子及其在不同碳氮源条件下的表达

Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子(C6zinc)在真菌次生代谢产物合成中发挥重要作用。本研究首先利用本地BLAST,从桑黄Sanghuangporussanghuang全基因组中获得Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子编码基因,并利用生物信息学手段分析编码蛋白保守结构域、一级结构及二级结构,构建蛋白系统发育树,最后利用半定量PCR对它们在不同碳源和氮源培养条件下的表达情况进行检测。结果显示:从桑黄基因组中分析获得的11个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白均具有Cy6型锌指基序,属于GAL4型锌簇蛋白转录因子;它们均为不稳定亲水性蛋白,具磷酸化修饰位点,糖基化修饰位点较少或没有,定位于细胞核中;其二级结构主要以无规卷曲和α螺旋为主;系统发育树分析结果显示,桑黄Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白分为2个大分支,其中Ⅰ类分支转录因子的保守结构域分布于蛋白N-端,Ⅱ类分支转录因子的保守结构域则分布于蛋白C-端;11个桑黄Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子在不同培养基培养的菌丝体中呈现差异化表达,其中,肌醇培养基和乳糖培养基能够有效促进大部分锌簇蛋白转录因子的表达;另外,基因簇分析显示桑黄锌簇蛋白SHCZ4可能是NRPS-PKS杂合基因簇体系的途经特异性转录因子。该结果将为桑黄次生代谢产物合成调控相关转录因子的研究以及潜在次生代谢相关基因簇的挖掘提供参考依据。

ILC2通过激活STAT6和分泌IL-13调节慢性肾功能衰竭患者的免疫功能

目的:探讨Ⅱ型固有淋巴细胞(ILC2)在慢性肾衰发生发展中的作用及其可能机制。方法:选择中山大学附属第一医院2016年3月~2016年12月入院的慢性肾功能衰竭患者36例,选取同期健康体检者32例为对照。流式细胞术(FCM)检测外周血单个核细胞(PBMC)中ILC2的比例;ELISA技术检测血浆中白细胞介素(IL)-13的浓度;提取慢性肾衰患者及健康对照者PBMC后分别分为3组(对照组、细胞因子刺激组、干预组)进行体外培养3 d后,ELISA法测定上清液中IL-13浓度;Western blot法对健康对照者PBMC在刺激前及刺激后15 min、30 min、1 h、2 h的转录活化因子6(STAT6)的磷酸化水平进行检测。结果:慢性肾功能衰竭患者PBMC中ILC2比例及血浆IL-13浓度均较健康人高(P<0.05);体外培养上清液中,慢性肾功能衰竭患者的3个亚组中IL-13浓度均较健康人高(P<0.05),且2类人群中均呈现出细胞因子刺激组较对照组升高,干预组较细胞因子刺激组降低的现象;Western blot结果显示p-STAT6的蛋白水平随时间的延长逐渐增高。结论:慢性肾衰患者外周血中ILC2的比例升高,同时ILC2内STAT6活化并分泌大量IL-13,介导Th2细胞的极化而调节免疫。