牛樟芝Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子的全基因组鉴定与分析

为深入了解牛樟芝Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子的功能,利用本地Blast对牛樟芝全基因组的蛋白序列进行全局比对,鉴定出20个牛樟芝Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子蛋白序列。通过生物信息学方法对Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子进行结构和功能预测,并利用转录组测序分析Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子在不同段木培养条件下菌丝体和子实体的表达情况。结果表明:20个Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子均具有Cy6型锌指基序,属于GAL4型锌簇蛋白转录因子,其氨基酸数量为225~1384个;理论等电点平均pI值为6.91,均为不稳定蛋白;其中,AcCys6-17存在跨膜结构;AcCys6-9、AcCys6-14定位在细胞质中;平均每个转录因子含9个外显子,AcCys6-6有25个外显子,二级结构以无规卷曲为主要结构。Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子基因表达在不同段木的菌丝体和子实体存在差异,有11个转录因子在香樟段木菌丝体表达量高,AcCys6-16在香樟段木子实体表达量高;AcCys6-11在牛樟段木菌丝体表达量高;AcCys6-4在云南樟段木菌丝体表达量最高。

木屑处理迷宫栓孔菌Zn(Ⅱ)-Cys(6)转录因子差异表达分析

Zn(Ⅱ)-Cys(6)蛋白是一类仅存在于真菌中的锌指转录因子,其在迷宫栓孔菌(曾用名“偏肿革裥菌”)Trametes gibbosa中的相关研究较少。本研究对木屑处理后的迷宫栓孔菌进行转录组测序分析,以期挖掘到差异表达的Zn(Ⅱ)-Cys(6)转录因子,为后续进一步对其功能的分析提供支持。首先,对在木屑处理下的T.gibbosa木质素降解酶进行了酶活检测,确认迷宫栓孔菌能有效降解木质素。之后,用木屑分别处理迷宫栓孔菌0、3、5、7和11d,提取菌丝总RNA,利用高通量测序技术对这5个菌丝样本进行了转录组测序分析。通过COG、GO、Pfam和Swiss等数据库进行功能注释分析,鉴定出迷宫栓孔菌中全部的Zn(Ⅱ)-Cys(6)家族转录因子基因,并进一步筛选出7个差异表达基因。进一步又对这7个差异基因的表达及蛋白结构进行了分析,绘制表达趋势热图,同时也对其理化性质,二、三级结构,疏水性等生物学特性进行了预测。通过构建系统发育树、预测Motif序列等初步分析了它们的进化关系及特性。最后,对这7个基因又利用RT-qPCR技术,进一步验证了转录组测序的结果。本研究从转录水平分析并鉴定出在木屑处理条件下迷宫栓孔菌中7个差异表达的Zn(Ⅱ)-Cys(6)转录因子,研究结果将对后续研究迷宫栓孔菌中Zn(Ⅱ)-Cys(6)转录因子的功能和表达调控机制有重要的参考价值。

参与丝状真菌次级代谢Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子的生物信息学分析

本研究根据在GenBank中已登录的扩展青霉(Penicillium expansum)中棒曲霉素簇转录因子PePatL、棒曲霉菌(Aspergillus clavatus)中棒曲霉素簇转录因子PatL、构巢曲霉(A. nidulans)中柄曲霉素转录因子AFLR、黄曲霉(A. flavus)中黄曲霉毒素转录因子AFLR、长毛柄孢壳菌(Podospora comata)中黑色素转录因子Cmr1p、轮状镰刀霉菌(Fusarium verticillioides)中富马菌素转录因子Fum21p、烟曲霉菌(As-pergillus fumigatus)中神经胶质毒素转录因子GliZ、紫红曲霉(Monascus purpureus)中橘霉素转录因子CtnR等8个参与丝状真菌次级代谢的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子,应用生物信息学软件预测了其保守结构域、疏水性、蛋白跨膜、亚细胞定位、二级结构、三级结构和蛋白相互作用网络等。结果显示:它们均具有保守区域为CX2CX6CX6CX2CX6C的锌指结构,且N-端都存在保守的GAL4域,富含丝氨酸(Ser),无明显跨膜结构域,无信号肽,为定位于细胞核的亲水性不稳定蛋白,属于非分泌型蛋白。蛋白序列在多个氨基酸位点均存在不同程度的磷酸化,其中丝氨酸发生磷酸化程度相对最高,在不同位置的磷酸化水平也不同。它们的二级结构均主要以无规则卷曲为主,三级结构也较为相似。蛋白相互作用网络预测8个转录因子的活性可以通过与其他全局性转录因子或蛋白间的相互作用进行调节。本研究的结果将为进一步研究丝状真菌次级代谢转录因子在次级代谢产物生物合成过程中的生物学功能提供一定的基础。

桑黄Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子及其在不同碳氮源条件下的表达

Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子(C6zinc)在真菌次生代谢产物合成中发挥重要作用。本研究首先利用本地BLAST,从桑黄Sanghuangporussanghuang全基因组中获得Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子编码基因,并利用生物信息学手段分析编码蛋白保守结构域、一级结构及二级结构,构建蛋白系统发育树,最后利用半定量PCR对它们在不同碳源和氮源培养条件下的表达情况进行检测。结果显示:从桑黄基因组中分析获得的11个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白均具有Cy6型锌指基序,属于GAL4型锌簇蛋白转录因子;它们均为不稳定亲水性蛋白,具磷酸化修饰位点,糖基化修饰位点较少或没有,定位于细胞核中;其二级结构主要以无规卷曲和α螺旋为主;系统发育树分析结果显示,桑黄Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白分为2个大分支,其中Ⅰ类分支转录因子的保守结构域分布于蛋白N-端,Ⅱ类分支转录因子的保守结构域则分布于蛋白C-端;11个桑黄Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子在不同培养基培养的菌丝体中呈现差异化表达,其中,肌醇培养基和乳糖培养基能够有效促进大部分锌簇蛋白转录因子的表达;另外,基因簇分析显示桑黄锌簇蛋白SHCZ4可能是NRPS-PKS杂合基因簇体系的途经特异性转录因子。该结果将为桑黄次生代谢产物合成调控相关转录因子的研究以及潜在次生代谢相关基因簇的挖掘提供参考依据。

ILT4促进脓毒症炎性反应并介导免疫麻痹

目的：探讨脓毒症单核细胞表达ILT4的生物学行为和效应，及对于预后的影响。方法：选取BALB/c、BALB/c ILT4–/–雄性小鼠，CLP复制脓毒症模型。用流式细胞仪定量检测CLP术后24h单核细胞ILT4、MHC-Ⅱ表达水平；用ELISA法检测各组0、6、12、24h血清IL-6、TNF-α浓度；并观察168h内生存预后。 结果：CLP术后24小时脓毒症小鼠外周单核细胞高度表达ILT4分子 （193.50 ± 52.54 vs. 1292.00 ± 143.70, p 〈 0.05） ；较WT组ILT4–/–小鼠外周单核细胞表达MHC-Ⅱ比率明显增高（24.25± 6.76% vs. 49.38 ±5.66%, p 〈 0.05） 。CLP术后24h血清IL-6显著增高（54.25± 20.04 vs. 470.75±88.03, p 〈 0.05），ILT4敲除后很大程度的抑制这一趋势（470.75±88.03 vs. 241.25 ± 45.10, p 〈 0.05）；但对TNF-α表达无显著性干扰（53.13 ±5.49 vs. 50.88 ±6.38, p〉 0.05）。且ILT4–/–小鼠CLP术后生存率WT明显增加（p 〈 0.05）。结论：脓毒症时单核细胞高表达ILT4，与高IL-6水平及低MHC-Ⅱ表达率相关，导致死亡率增加。