hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白的制备、穿膜效应及其抗氧化、抗炎症功效

目的 探究人源性细胞膜穿透肽hPP10携带人源性抗氧化蛋白Cu,Zn-SOD的穿膜效应并观察其抗氧化、抗炎功效。方法利用RT-PCR技术扩增人源性SOD基因片段、酶切连接法构建重组质粒pET15b-Cu,Zn-SOD,pET15b-hPP10-Cu,Zn-SOD;利用镍柱亲和层析法、分子筛方法纯化Cu,Zn-SOD、hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白并利用Western blotting法鉴定其正确性;利用免疫荧光法、荧光共定位实验、Western blotting法鉴定hPP10-Cu,Zn-SOD在细胞中的穿膜效应;利用Western blotting法鉴定hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白穿膜时间梯度和浓度梯度效应;利用SOD酶活性测定试剂盒检测hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后的SOD酶活性;利用MTT法检测hPP10对细胞活性的影响。利用H2O2建立HEK293氧化应激细胞模型,通过流式细胞分析术(FCM)分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后细胞凋亡情况;并RT-qPCR分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后凋亡相关因子的表达情况;通过ROS检测分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后抗氧化能力。TPA诱导建立小鼠耳部炎症模型(5只/组,共4组),然后RT-qPCR分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后,NFκB,IL-1β、IL-6、TNFα因子的转录情况;Western blotting检测NFκB p65、p-NFκB p65、IL-1β、TNFα基因的表达;免疫组化分析炎性因子p-NFκB p65、TNFα基因的表达。结果 成功构建了重组质粒pET15b-Cu,Zn-SOD,pET15b-hPP10-Cu,Zn-SOD,并获得Cu,Zn-SOD蛋白和hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白;免疫荧光试验结果表明5μmol/L浓度的hPP10-Cu,Zn-SOD转导HEK293细胞具有明显的穿膜效应;荧光共定位实验显示融合蛋白hPP10-Cu,Zn-SOD入胞后定位在细胞膜内,部分蛋白定位在细胞核内;Western blotting实验结果表明hPP10-Cu,Zn-SOD转导Hela(P<0.05),HEK293(P<0.01)细胞具有浓度依赖性,细胞内hPP10-Cu,Zn-SOD存在可持续24 h;5μmol/L的hPP10-Cu,Zn-SOD转导细胞具有较好的抗氧化活性(P<0.01);MTT结果显示高达10μmol/L浓度的hPP10-Cu,Zn-SOD对于细胞活力的影响小。在氧化应激模型中,FCM结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞降低了细胞的早期凋亡(P<0.01)和晚期凋亡(P<0.05);RT-qPCR结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞使Bcl2、Mcl1、Deptor等抗凋亡因子升高(P<0.05),降低了Bad、P21、P27等促凋亡因子的表达(P<0.05);ROS结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞显著降低了细胞内的活性氧含量(P<0.01)。在炎症模型中,hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白可显著降低IL-1β、IL-6、TNFα因子的转录(P<0.05);p-NFκB p65、IL-1β及TNFα的表达都呈现了抑制作用(P<0.05);hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白处理组较Cu,Zn-SOD蛋白处理组,降低了炎性因子p-NFκB p65及TNFα基因的表达(P<0.05)。结论 融合蛋白hPP10-Cu,Zn-SOD具有明显的穿膜入胞、抗氧化、抗炎功效,且对细胞毒副作用很小。这些结果为hPP10作为新的递送载体奠定基础,也为hPP10-Cu,Zn-SOD应用于护肤品等提供了理论依据。

丝瓜铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族的克隆与表达分析

【目的】克隆丝瓜铜/锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族,并分析其序列特征、表达情况及其在丝瓜褐变中的作用,为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理提供科学依据,为丝瓜品种遗传改良奠定基础。【方法】通过转录组测序和RT-PCR方法获得丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族的c DNA序列,采用生物信息学方法分析氨基酸序列,利用荧光定量PCR技术研究Cu/Zn-SOD基因家族在不同组织及褐变条件下的表达情况。采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定总超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用福林-酚比色测定总酚含量。【结果】获得了3个丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族c DNA序列,依次命名为Lc Cu/Zn-SOD1(Gen Bank登录号:KP178922)、Lc Cu/Zn-SOD2(Gen Bank登录号:KX092445)和Lc Cu/Zn-SOD3(Gen Bank登录号:KX092446)。Lc Cu/Zn-SOD1全长758 bp,包含一个456 bp的开放读码框(ORF),编码152个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD2全长799 bp,ORF为471 bp,编码157个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD3全长1 011 bp,ORF为663 bp,编码221个氨基酸;编码的蛋白与甜瓜、南瓜、黄瓜同源蛋白的相似性均在90%以上。生物信息学分析表明3个基因编码的酶蛋白均无信号肽,无跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质。Cu/Zn-SOD基因家族在根中的表达量最高,在花中表达量最低。在丝瓜采后储藏期间,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在丝瓜储藏初期表达量较采后当时(0 d)上调,后期表达量受到抑制;在丝瓜鲜切条件下,3个基因表达量在鲜切后较采后当时(0 h)总体呈下降趋势。相关性分析显示,在采后储藏和鲜切条件下,Lc Cu/Zn-SOD1表达量均与SOD酶活性呈极显著性正相关,Lc Cu/Zn-SOD3表达量均与SOD酶活性呈显著性正相关,SOD酶活性在鲜切条件下与总酚含量呈显著负相关,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在调控SOD酶活性方面起作重要作用,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3的表达影响了SOD酶活性,并影响了丝瓜褐变进程。【结论】从丝瓜果肉中获得Cu/Zn-SOD基因家族的3个,其中Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用。

Cu/Zn-SOD基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

为研究Cu/Zn-SOD基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用,从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)中克隆得到Cu/Zn-SOD基因,以pZP211质粒为表达载体,构建了植物表达载体pZP211-Cu/ZnSOD,并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化。经PCR检测证明已获得转Cu/Zn-SOD基因的烟草。进而测定转基因烟草的SOD活力,结果表明Cu/Zn-SOD基因在烟草中高效表达。对转基因烟草进行耐盐性检测,证明Cu/Zn-SOD基因确实能够提高烟草对盐胁迫的耐受性。

丹参铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆与生物信息学分析

依据已构建的丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)cDNA文库和降落PCR的方法获得丹参胞质铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因,并用生物信息学方法对该基因编码产物从氨基酸组成、理化性质、亲水性/疏水性、二级结构以及功能等方面进行了预测和分析.结果表明,克隆得到的丹参Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和延伸链等蛋白质二级结构元件构成,与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD在序列组成、结构及活性位点等方面均有高度的相似性.

荔枝古树胚性愈伤组织LcCu/Zn-SOD3基因启动子的克隆及功能验证

以荔枝古树"宋荔"胚性愈伤组织为材料,采用接头染色体步移法,分离获得LcCu/Zn-SOD3启动子片段长度为1 426bp,命名为ProLcCSD3(GenBank登录号:KF672186.1)。生物信息学分析表明,该启动子含有多个逆境应答元件、激素应答元件、胚乳特异表达元件,且可能受WRKY和MYB等转录因子调控。通过双酶切方法,以ProLcCSD3替换载体pCAMBIA1301上的CaMv35S启动子,构建了重组质粒p1301-proLcCSD3-GUS,并成功转化农杆菌EHA105和GV3101。注射烟草的瞬时表达分析表明,该启动子片段可以驱动下游报告基因表达。转化拟南芥分析表明,该启动子驱动的下游GUS可以在拟南芥的根、茎、叶中表达,且可响应NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和损伤等非生物胁迫。研究表明,荔枝古树LcCu/Zn-SOD3可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号转导途径。

哈密瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及生物信息学分析

依据NCBI中已克隆的葫芦科植物黄瓜和西瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,以哈密瓜果肉总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,最终获得一段403bp的哈密瓜Cu/Zn-SOD(HmCu/Zn-SOD)基因片段,运用Blast比对,系统进化树分析最终确定所克隆的基因片段为哈密瓜的Cu/Zn-SOD基因序列。运用蛋白质分析软件分析结果表明,克隆得到的哈密瓜Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和β-折叠等蛋白质二级结构元件构成,同时与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD的组成成分和理化性质具有高度的相似性。

人Cu,Zn-SOD在酵母系统中的表达

甲醇酵母 (Pichia pastoris)是一种理想的真核蛋白高水平表达系统。将人 Cu,Zn- SOD基因克隆到酵母整合型质粒载体 p PIC3.5K,经转化 his4缺陷型酵母 GS1 1 5,用 MD培养基及 PCR方法筛选阳性转化子 ,并用含 G41 8的 YPD培养基筛选多拷贝转化子 ,经甲醇诱导表达。 SDS-PAGE和蛋白质印迹杂交结果证实了表达产物为重组的人 Cu,Zn- SOD,经计算机扫描分析 ,表达量占酵母可溶性蛋白的 1 4% ,所表达的人 Cu,Zn- SOD比活可达每毫克蛋白质 77U。

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。

耐热、高产重组人Cu,Zn-SOD改构体的构建及纯化方法的研究

目的通过对天然人Cu,Zn-SOD基因的改造,得到热稳定性、活性产量提高的重组人Cu,Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)改构体,并进行蛋白纯化方法的研究。方法重叠PCR技术将天然hCu,Zn-SOD的Cys6突变为A la6,Cys111突变为Ser111,构建重组质粒pET22b-rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后SDS-PAGE分析改构体蛋白的表达,并进行W estern blot鉴定;研究改构体蛋白的纯化方法,HPLC检测蛋白纯度,比较rhCu,Zn-SOD及其改构体的活性和热稳定性。结果成功构建了rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser表达载体;SDS-PAGE显示rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser蛋白在BL21(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量占菌体蛋白总量的64.6%;Western blot结果显示表达产物可以特异性地与小鼠抗人SOD多克隆抗体结合;纯化得到纯度大于95%的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Se改构体蛋白,从1g湿菌体中获得的活性蛋白总量高于未改构体的2倍;改构体的热稳定性较未改构体获得大幅提高。结论构建的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser改构体具有较好的热稳定性和较高的活性产量,摸索出一种比较简易的蛋白纯化工艺,为Cu,Zn-SOD的广泛应用奠定基础。

miRNA398调控烟草Cu/Zn-SOD基因的表达

模式植物miRNA398可以抑制靶基因Cu/Zn-SOD的表达。为揭示烟草miRNA398的生物学功能,采用荧光定量PCR技术分析了烟草品种CB-1和B37在干旱胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的表达量,并预测了烟草miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的位点。结果表明:烟草miRNA398与Cu/Zn-SOD基因5非翻译区的21个碱基序列互补,从而抑制该基因的表达;在干旱胁迫条件下,CB-1的miRNA398表达水平上升,B37的miRNA398表达水平下降,Cu/Zn-SOD基因表现出与miRNA398相反的表达趋势,说明抗旱能力存在差异的两个品种中miRNA398均可抑制Cu/Zn-SOD基因表达,并且对干旱胁迫响应具有两种不同的方式。

小葱叶胞质中3种Cu·Zn-SOD的纯化及性质研究

超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）是一种消除体内氧自由基损伤的重要因子，可分为ＣｕＺｎ－ＳＯＤ、Ｍｎ－ＳＯＤ和Ｆｅ－ＳＯＤ．作者在小白菜叶中曾发现５种ＳＯＤ，已鉴别其中一种为Ｍｎ－ＳＯＤ，来源于线粒体［１］；其余４种为ＣｕＺｎ－ＳＯＤ，其中２种分别来源于胞质［...

玉米芯硫酸酯化多糖对荷瘤小鼠血浆Cu·Zn-SOD及MDA的影响

目的探讨玉米芯硫酸酯化多糖(CCCS)对荷瘤小鼠机体抗氧化作用及抗肿瘤机制的关系。方法采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法分别测定荷瘤小鼠血浆Cu.Zn-SOD活力和MDA含量。结果CCCS对荷瘤小鼠的抑制作用较显著(P<0.05),抑瘤率可达34%以上,其可以增加荷瘤小鼠血浆Cu.Zn-SOD活力(P<0.05),降低荷瘤小鼠血浆MDA的含量(P<0.05)。结论CCCS可以通过提高机体抗氧化能力而抑制肿瘤的生长。

构建人Cu,Zn-SOD毕赤酵母转化子及其高表达研究

设计人Cu,Zn-SOD酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的人Cu,Zn-SOD基因真核表达载体,通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,基因拷贝数提高2～8倍,活性检测显示提高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,其分子质量为40kD左右,低糖基化,均为分泌表达。Western blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定;Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0、30℃、体积分数1.5%甲醇诱导72h测得上清的目的蛋白表达最好,表明构建了高表达菌株。

半番鸭不同组织Cu/Zn-SOD基因表达及酶活性研究

【目的】首次对半番鸭不同组织Cu/Zn-SOD基因表达、酶活性进行研究,以期了解半番鸭不同组织抗氧化特性,为深入研究半番鸭对环境因子的响应能力及相关分子机制提供参考。【方法】通过实时荧光定量法、黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法分别测定了半番鸭心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌胃和胸肌中的Cu/Zn-SOD mRNA相对表达量、酶活力和MDA含量。【结果】Cu/Zn-SOD mRNA在胸肌中相对表达量最高,总体趋势为胸肌>肝脏>肺>心脏>脾脏>肾脏/肌胃。酶活力测定结果显示,肝脏和肾脏Cu/Zn-SOD酶活力显著高于胸肌和肌胃。半番鸭胸肌MDA含量显著高于肝脏、肌胃和肾脏,提示胸肌可能更易受到氧化应激损伤。相关分析结果显示Cu/Zn-SOD活力与MDA含量呈显著负相关,而抗氧化酶活力与mRNA表达水平相关性不显著。【结论】半番鸭Cu/Zn-SOD基因表达和酶活力具有组织特异性。不同组织Cu/Zn-SOD活力差异可能与Cu/Zn-SOD自身的生理功能以及组织代谢水平有关。

鹅红细胞Cu,Zn-SOD分离纯化及部分性质的研究

经氯仿-乙醇分级分离,丙酮沉淀及DE-32纤维素柱层析的方法,从鹅红细胞中得到纯化的Cu,Zn-SOD。结果表明此酶的比活力为10656.14U/mg,提纯倍数为354.73,聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白带与活性带相对应。相对分子量约为32000,相对亚基分子量约为16000。最大紫外吸收波长为258nm,对KCN和H2O2敏感,最适pH为6～9,热稳定性在60℃以下。

转hCu,Zn-SOD突变基因聚球藻抗氧化作用的研究

目的研究转人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)突变基因聚球藻口服后的生物活性。方法给小鼠灌服转hCu,Zn-SOD突变基因聚球藻20d,然后测定小鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活力以及丙二醛(MDA)含量。结果转hCu,Zn-SOD突变基因聚球藻可明显提高小鼠血清GSH-Px活力和全血血红蛋白CAT活性,显著提高小鼠血清和肝脏中Cu,Zn-SOD和总SOD(T-SOD)的活力,显著降低小鼠血清和肝脏的MDA含量。结论转hCu,Zn-SOD突变基因聚球藻有较强的抗氧化作用。

牦牛血红细胞Cu Zn-SOD稳定性的研究

研究了牦牛血红细胞Cu、Zn-SOD的部分理化性质,结果表明其分子量、紫外吸收率与黄牛SOD的接近,而在Cu和Zn的含量方面存在较大差异。牦牛Cu、Zn-SOD对pH及温度的变化不敏感,但抗胰蛋白酶和抗H_2O_2的能力稍差。

猪血Cu,Zn-SOD的分离纯化

用加热变性、盐析和凝胶过滤层析的方法从猪血中提取分离出有多种生理活性的Cu ,Zn SOD ,经过分析得知 ,其比活为 1 0 0 3 5u/mg、分子量为 3 1 70 0u的电泳纯单组分。

茶树花Cu/Zn-SOD酶活性及其基因表达分析

为研究Cu/Zn-SOD基因在茶树花不同发育阶段、不同品种间的表达规律以及Cu/Zn-SOD基因表达量与酶活性之间的关系,本研究将‘龙井43’品种茶树花分为4个发育阶段,选择15个品种的茶树花为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术对3个Cu/Zn-SOD基因表达水平进行定量分析,同时测定Cu/Zn-SOD酶活性。结果表明:在茶树花的4个发育阶段中,第4阶段Cu/Zn-SOD酶活性最低,与其他3个阶段具有显著差异;不同品种的茶树花Cu/Zn-SOD酶活性有较大差异,其中‘紫鹃’茶树花Cu/Zn-SOD酶活性最高,其次是‘黄金芽’和‘白叶1号’,‘黄观音’的Cu/Zn-SOD酶活性最低。茶树花不同发育阶段中Cu/Zn-SOD基因表达水平存在较大差异,细胞质型Cu/Zn-SOD1基因表达水平远高于叶绿体型Cu/Zn-SOD2和过氧化物酶体Cu/Zn-SOD3;不同品种茶树花Cu/Zn-SOD基因表达水平有较大差异,Cu/Zn-SOD1基因在‘黄牡丹’茶树花中表达量最高,Cu/Zn-SOD2基因在‘白叶1号’和‘黄观音’茶树花中表达量最高,Cu/Zn-SOD3基因在‘紫鹃’茶树花中的表达量最高。相关性分析得知‘龙井43’茶树花不同发育阶段Cu/Zn-SOD酶活性与Cu/Zn-SOD基因表达量之间的相关性不明显,而不同品种茶树花的Cu/Zn-SOD酶活性与Cu/Zn-SOD3基因表达量存在显著相关性。本研究初步明确了Cu/Zn-SOD酶活性较高的茶树品种和茶树花适宜的采摘时间,为茶树花SOD进一步研究提供参考。

Cu,Zn-SOD在银电极上的原位表面增强Raman光谱

本文应用原位共焦拉曼光谱技术观察了Cu ,Zn -SOD分子在经表面增强处理后的银电极上 ,吸附状态随电位跃迁变化的过程。结果表明在 -0 2V～ 0 1V的电位区间内 ,Cu,Zn -SOD分子经由羧酸根离子吸附于银电极表面 ,而在 0 2～ 0 4V电位区间内发生脱附 ,表面吸附的物种改变为缓冲溶液中的磷酸根离子。上述结果为SOD分子在固体电极表面电子传递机制的探索提供了依据。