ZnuA基因缺失对致病性大肠杆菌生物学特性的影响

目的为研究Zn 2+转运系统ZnuABC关键分子ZnuA对致病性大肠杆菌生物特性的影响。方法利用λRed同源重组方法构建大肠杆菌CL-1菌株ZnuA基因缺失菌株,对比ZnuA基因缺失前后大肠杆菌生长、生化特性的改变,以及大肠杆菌的生物被膜产生、抗生素敏感性及其对结肠腺癌细胞的黏附能力的差异。结果成功构建大肠杆菌CL-1菌株ZnuA基因缺失菌株CL-1ΔZnuA和回补菌株CL-1ΔZnuA/pZnuA,生长曲线结果显示,在低浓度Zn 2+条件下,CL-1ΔZnuA的生长明显弱于野生型菌株和回补菌株,但生化特性无改变。生物被膜形成测定试验结果显示,ZnuA基因缺失能够减少40%大肠杆菌生物被膜形成能力,并明显增加大肠杆菌对氧氟沙星的敏感性。黏附试验结果显示,在细菌培养时添加螯合剂处理,缺失菌株CL-1ΔZnuA对CaCO-2细胞的黏附能力明显下降。小鼠模型显示,ZnuA基因缺失会引起大肠杆菌毒力的显著下降。结论锌获取蛋白ZnuA的缺失会导致大肠杆菌多种生物特性的改变,揭示了锌元素对致病性大肠杆菌致病的重要作用,为后续大肠杆菌病的防控提供了依据。

布鲁菌缺失疫苗株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA的构建及毒力和免疫原性的评估

【目的】利用分子生物学技术,通过同源重组的方法构建了新型的羊种布鲁菌Brucella melitensis减毒活疫苗株,为布鲁菌的防治提供新的选择.【方法】以羊种布鲁菌减毒活疫苗M5株及缺失bp26基因的M5-Δbp26缺失突变株为亲本株,利用电击转化法,将含有znuA基因上下游同源臂的自杀质粒转入到亲本株中,通过同源重组敲除znuA基因.对构建的新型基因缺失株进行生物学特性及毒力的鉴定与分析.【结果和结论】PCR及核苷酸序列测序结果表明,羊种布鲁菌减毒活疫苗znuA单基因缺失株和bp26、znuA双基因缺失株均构建成功,分别将其命名为M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA.与亲本株相比,2种缺失突变株的生物学特性没有显著性差异;体外连续传至20代后,菌落PCR和核苷酸测序结果显示M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA株具有良好的遗传稳定性.小鼠脾脏质量和脾脏菌落数表明,M5-Δbp26-ΔznuA双基因缺失株毒力最弱,单基因缺失株M5-ΔznuA和M5-Δbp26次之.血清中抗体水平的监测显示,znuA基因的缺失对布鲁菌减毒活疫苗诱导机体体液免疫的能力没有影响.获得了免疫原性保持良好而毒力减弱的羊种布鲁菌减毒活疫苗基因突变株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA.

牛多杀性巴氏杆菌znuA基因的原核表达及其免疫保护作用的研究

为研究牛多杀性巴氏杆菌(P.multocida)高亲和力锌吸收蛋白znuA的免疫学活性及其免疫保护作用,本研究利用PCR方法扩增了P.multocida znuA基因,构建表达载体pET-28a-znuA,将其转化E.coli BL21后经诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白约40 ku;以重组znuA蛋白免疫小鼠后用P.multocida菌株Y-1攻毒,结果显示重组znuA蛋白对免疫组小鼠保护率为60%,表明其具有免疫保护作用。本研究首次在原核系统中表达了P.multocida znuA蛋白,且验证了其免疫保护力,为深入探究znuA基因在P.multocida致病过程中的作用及其亚单位疫苗的开发奠定了基础。

2型猪链球菌中国强毒株znuA基因的原核表达及免疫学活性分析

目的克隆2型猪链球菌高亲和力锌吸收蛋白(High-affinity zinc uptake system protein,ZnuA)编码基因并进行原核表达,研究ZnuA蛋白的免疫学活性。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因znuA,构建重组表达质粒pET32a::znuA,转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;Western blot检测ZnuA蛋白的免疫原性;重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA检测多抗血清效价。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;Western blot结果表明ZnuA蛋白具有良好的免疫原性;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的多抗血清。结论在原核系统中成功地表达了znuA基因编码的蛋白,且ZnuA重组蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究znuA基因在猪链球菌致病过程中的作用以及猪链球菌疫苗的开发奠定了基础。

布鲁菌S19疫苗株znuA单基因及bp26/znuA双基因缺失株的构建及鉴定

通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。

2型猪链球菌锌转运蛋白A对小鼠免疫保护作用

目的研究猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)锌转运蛋白A(ZnuA)对小鼠接种致死量2型猪链球菌(S.suis 2)菌株的免疫保护作用,为进一步研究S.suis 2亚单位疫苗奠定实验基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)检测znuA基因在不同血清型S.suis中的分布情况;蛋白免疫印迹(western blot)检测ZnuA在S.suis 2的表达,利用流式细胞术对ZnuA进行细胞定位,动物实验研究ZnuA蛋白的免疫保护作用。结果除血清型17、21和30型菌株及荷兰分离株T15菌株外,其他30个血清型S.suis菌株、7996菌株以及3株S.suis 2型国内分离菌株基因组中均扩增到目的条带;S.suis 2菌体蛋白与兔抗ZnuA蛋白的血清能发生特异性反应;兔抗ZnuA血清标记S.suis 2的荧光强度明显较高;ZnuA重组蛋白免疫组小鼠死亡率较低。结论 ZnuA是一种具有免疫保护作用的蛋白,可作为S.suis的亚单位疫苗候选分子。