左金方体内外抑制幽门螺杆菌的实验研究

目的:探讨左金方在体内外抑制幽门螺杆菌(hlicobacter pylori,Hp)生长繁殖的作用。方法:采用琼脂稀释法测定左金方和克拉霉素对Hp最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。60只BALB/c小鼠雌雄各半,按体质量分层随机分为正常组、模型组、胃三联组(0.351 mg·g^(-1))及左金方低、中、高剂量组(0.364,0.728,1.456 g·kg^(-1)·d^(-1))6组,采用抗生素加Hp的方法连续灌胃7 d建立Hp感染动物模型。从第11天开始连续灌胃给药8周后处死小鼠,进行血清尿素酶抗体检测以及病理切片检查。结果:琼脂稀释法测得左金方最小MIC值为200μg·mL^(-1),克拉霉素最小MIC值为0.5μg·mL^(-1)。血清幽门螺杆菌抗体检测、小鼠胃黏膜病理切片结果均提示Hp感染动物模型复制成功,与正常对照组比较差异有统计学意义。胃三联组、左金方高、中、低剂量组均能有效抑制体内Hp的生长,与模型对照组比较差异有统计学意义。结论:左金方在体内体外均能有效地抑制幽门螺杆菌的生长。

左金方及其组方成分对人胃癌细胞SGC-7901凋亡及膜电位的影响

目的比较左金方及其组方成分(黄连、吴茱萸及巴马汀、小檗碱、药根碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱)对人胃癌细胞SGC-7901生长的活性抑制、凋亡诱导和膜电位的影响。方法采用MTT比色法观察受试药物对SGC-7901的生长抑制情况;流式细胞仪PI单染亚二倍体峰分析细胞凋亡率;以及JC-1试剂盒测定细胞膜电位。结果左金方、黄连、巴马汀和小檗碱分别作用SGC-7901细胞后,均能抑制细胞活性,且呈时间依赖性;1.0 mg·m L-1左金方和对应浓度的黄连(0.857 mg·m L-1)、巴马汀(9.19μg·m L-1)、小檗碱(39.85μg·m L-1)作用于SGC-7901细胞48 h,细胞凋亡率分别为(36.40±1.59)%,(21.90±0.27)%,(9.32±2.58)%和(13.89±3.56)%,与对照组(1.69±1.91)%比较差异均有统计学意义(P<0.01),左金方与黄连、巴马汀、小檗碱组间比较差异亦具有统计学意义(P<0.01)。对应浓度的吴茱萸(0.143mg·m L-1)、药根碱(4.86μg·m L-1)、吴茱萸碱(0.17μg·m L-1)与吴茱萸次碱(0.19μg·m L-1)几乎无作用。JC-1染色检测结果显示,左金方及相应浓度的黄连、巴马汀和小檗碱作用SGC-790l细胞4 h后,可以明显引起细胞线粒体膜电位的下降,实验结果与凋亡检测结果相一致。结论左金方、黄连、巴马汀和小檗碱均能通过降低细胞线粒体膜电位,诱导胃癌细胞的凋亡,且左金方的作用优于黄连、小檗碱和巴马汀,但吴茱萸及其有效成分几乎无作用。

左金方通过上调Bax/Bcl-2下调MMP诱导人胃癌细胞SGC-7901的凋亡

目的研究左金方诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的作用机制。方法采用MTT比色法观察左金方对SGC-7901的生长抑制情况;流式细胞仪PI单染亚二倍体峰分析细胞凋亡率;Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化;Western blot方法检测Bcl-2、Bax蛋白表达以及JC-1试剂盒测定细胞膜电位。结果左金方能抑制细胞活性,与时间-剂量呈依赖关系。0.1、0.5和1.0 mg·m L-1左金方作用于SGC-7901细胞48 h后,细胞凋亡率分别为(11.60±1.24)%、(21.80±0.28)%、(36.40±1.59)%,与对照组(2.66±1.33)%比较差异均有统计学意义(P<0.01);Hochest染色细胞出现核固缩状和颗粒状荧光等典型的凋亡学特征;左金方可降低SGC-7901细胞Bcl-2基因表达和增加Bax基因表达;左金方作用SGC-790l 4 h后,可以明显引起细胞MMP的下降;1.0 mg·m L-1左金方组的作用尤其明显。结论左金方通过上调Bax/Bcl-2比率,下调MMP诱导了人胃癌细胞SGC-7901的凋亡。

左金方和5-FU对胃癌细胞生长及BAX/Bcl-2表达的调控研究

目的:研究左金方和5-FU单独与联合对人正常胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌MGC803细胞生长及凋亡的影响及对BAX/Bcl-2蛋白表达水平的改变。方法:将不同浓度的左金方、5-FU及两药联合作用于体外培养的人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞MGC803,Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞增殖率的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测bcl-2、bax蛋白表达。结果:1.00 ug·mL^(-1)左金方、50.00、100.00 ug·mL^(-1)5-FU作用GES-1细胞24 h后,细胞存活率分别为(107.54±2.25)%、(53.67±1.91)%和(47.43±1.35)%,作用MGC803细胞24 h后,细胞凋亡率分别为(45.46±1.66)%、(37.02±1.68)和(45.60±1.14)%;左金方联合5-FU(1.00+50.00)、左金方联合5-FU(1.00+100.00)作用GES-1细胞24 h后,细胞存活率分别为(81.66±2.22)%和(78.68±2.10)%,作用MGC803细胞24 h后,相应的凋亡率为(61.30±1.71)%和(71.30±1.79)%,与单独用药比较差异有统计学意义。Western Blot凝胶电泳图可以看出,左金方联合5-FU(1.00+50.00)、左金方联合5-FU(1.00+100.00)作用MGC803细胞24 h后,进一步促进Bax的表达,降低Bcl-2的表达,与各单独用药组比较差异有统计学意义。结论:左金方与5-FU联合用药有大幅降低5-FU细胞毒性作用,显著提高人正常胃黏膜上皮细胞GES-1的存活率;通过促进MGC803细胞中Bax蛋白的高表达和Bcl-2的低表达,促进人胃癌细胞的凋亡。

左金方与反左金方抗MPP^+诱导SH-SY5Y细胞凋亡作用的对比研究

目的研究左金方和反左金方水提物对四氢吡啶离子(MPP+)诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法体外培养SH-SY5Y细胞,建立MPP+致SH-SY5Y细胞凋亡的模型,同时给予左金方和反左金方水提物干预。应用MTT比色法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hochest染色观察凋亡细胞形态学的改变。结果0.5 mmol·L-1 MPP+作用于SH-SY5Y细胞60 h可诱导细胞凋亡,细胞存活率降低至(50.87±2.31)%,凋亡率增加至(43.38±1.49)%,Hochest 33258染色可见明显的颗粒状和固缩状荧光。左金方和反左金方水提物与0.5 mmol·L-1 MPP+同时处理SH-SY5Y细胞后,能够明显改变细胞的凋亡学特性,当药物浓度增加到2.0 mg·m L-1时,细胞存活率分别升高至(63.16±1.89)%和(75.19±1.97)%,与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);其凋亡率由模型组的(43.38±1.49)%分别降低到(20.17±1.43)%和(9.41±1.27)%(P<0.01),反左金方(热性)抗凋亡的作用更强。结论左金方(寒性)和反左金方(热性)均能对抗由MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡,而反左金方(热性)抗凋亡作用更强,中药药性不同,其抗凋亡作用亦不同。

左金方、黄连、吴茱萸诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的作用比较

目的:比较左金方、黄连、吴茱萸对人胃癌细胞SGC-7901生长的活性抑制和凋亡诱导作用。方法:采用MTT比色法观察左金方、黄连、吴茱萸对SGC-7901的生长抑制情况;流式细胞仪PI单染亚二倍体峰分析细胞凋亡率;Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化以及Western blot方法检测左金方、黄连、吴茱萸对人胃癌细胞SGC-7901中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果:左金方和黄连分别作用SGC-7901细胞后,均能抑制细胞活性,且与时间呈依赖关系;1.0 mg·m L-1左金方和对应浓度的黄连(0.857 mg·m L-1)作用于SGC-7901细胞48 h,细胞凋亡率分别为(36.40±1.59)%和(21.90±0.27)%,与对照组(1.69±1.91)%比较差异均有统计学意义(P<0.01),组间比较差异均有统计学意义(P<0.01),对应浓度的吴茱萸(0.143mg·m L-1)几无作用;Hochest染色细胞出现核固缩状和颗粒状荧光等典型的凋亡学特征;左金方和黄连均可降低SGC-7901细胞Bcl-2基因表达和增加Bax基因表达。结论:左金方与黄连均可通过上调Bax/Bcl-2的比率诱导胃癌细胞的凋亡,但左金方的作用优于黄连(P<0.01),吴茱萸几无作用。

左金方及其主要成分小檗碱对人胃癌细胞SGC7901上皮间质转化的影响

目的：研究左金方及其主要成分小檗碱对人胃癌细胞SGC7901上皮间质转化的影响。方法：制备左金方冻干粉,采用高效液相色谱法（HPLC）,对比小檗碱对照品,明确左金方冻干粉的纯度和小檗碱含量;采用噻唑蓝（MTT）比色法检测左金方及小檗碱对SGC7901细胞生长影响,并确定后续实验给药浓度;划痕实验检测左金方及小檗碱对SGC7901细胞迁移能力的影响;细胞侵袭实验（transwell小室）检测左金方及小檗碱对SGC7901细胞侵袭能力的影响;采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测左金方及小檗碱作用SGC7901细胞24 h后对上皮间质转化（EMT）标志性蛋白上皮型钙黏蛋白（Ecadherin）,神经型钙黏蛋白（N-cadherin）蛋白表达的影响。结果：制备的左金方冻干粉含9.85%的小檗碱;左金方、小檗碱对SGC7901细胞作用24 h的半数抑制浓度（IC（50））分别为165,51.8 mg·L^-1,选用165 mg·L^-1左金方（含小檗碱16.3 mg·L^-1）与16.3 mg·L^-1小檗碱进行后续实验;左金方及小檗碱均能抑制SGC7901细胞划痕愈合及侵袭能力;Western blot结果显示,与空白组比较,左金方及小檗碱能明显上调E-cadherin表达,下调N-cadherin表达（P〈0.05）。结论：左金方及其主要成分小檗碱能抑制人胃癌细胞SGC7901的生长、侵袭及迁移,能抑制SGC7901细胞上皮间质转化,且小檗碱在复方中为其主要药效成分。