HeLa细胞中Zwint-1选择剪接亚型v7的表达鉴定

目的:验证在HeLa细胞系中是否存在Zwint-1 v7选择性剪切亚型的mRNA和蛋白产物。方法:在缺失片段两侧设计引物,利用PCR和克隆测序验证HeLa细胞中是否存在缺失片段的mRNA;构建Zwint-1 v7 3′端特异区段(Z7)的GST融合表达载体pGEXKG-GST-Z7,转化入BL21菌种诱导表达,菌体经超声破碎和2 mol/L尿素洗涤纯化,融合蛋白经SDS-PAGE电泳并切胶回收后作为抗原与佐剂混合乳化并免疫C57BL/6小鼠,收获多克隆抗血清Anti-Z7,采用Dot b lot检测多克隆抗体的效价,Western blot检测HeLa细胞全蛋白中的Z7蛋白产物。结果:PCR和测序结果表明存在缺失37 bp的核酸片段;SDS-PAGE电泳显示在30.7 kDa处出现明显的蛋白条带;Dot blot结果表明1∶5 000稀释的多克隆抗体能检出12 ng GST-Z7;Western blot结果表明,1∶200稀释的多克隆抗体可识别HeLa细胞中Zwint-1 v7蛋白。结论:本研究在核酸水平和蛋白水平初步验证了HeLa细胞中存在Zwint-1 v7。

生物信息学分析萝卜硫素上调RAB7交互溶酶体蛋白与非小细胞肺癌细胞自噬的关联

目的研究萝卜硫素(sulforaphane,SFN)抑制非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞自噬溶酶体形成的机制。方法利用免疫荧光共聚焦技术观察溶酶体在非小细胞肺癌细胞A549中的亚细胞定位;使用高效液相色谱与质谱联用分析SFN(20μmol/L)处理A549细胞后蛋白质组的表达差异;分别使用不同浓度的SFN(0,10,20,30μmol/L)处理人非小细胞肺癌A549细胞,通过蛋白免疫印迹技术检测RILP蛋白的表达。利用TCGA及UNLCAN数据库分析肺癌组织与癌旁组织中RAB7交互溶酶体蛋白(RILP)及ATP6V0D1蛋白的差异表达;利用ONCOLNC数据库分析RILP及ATP6V0D1与肺癌患者生存期的关联;利用TCGA数据库分析在肺腺癌和肺鳞癌组织中RILP与自噬相关蛋白LC3Ⅱ、RILP与ATP6V0D1、ATP6V0D1与LC3Ⅱ的相关性;利用STRING数据库分析RILP蛋白与微管蛋白TUBB/TUBA1A、LC3Ⅱ间的相互作用。结果在SFN处理的A549细胞中观察到溶酶体发生核周聚集。液相色谱和质谱联用分析表明:在SFN处理的A549细胞中,380个蛋白表达上调,278个蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白免疫印迹结果显示:随着SFN浓度(0,10,20,30μmol/L)的升高,RILP的表达显著上升(P<0.05)。TCGA数据库结果显示:RILP、ATP6V0D1蛋白在非小细胞肺癌组织中低表达(P<0.05)。与高表达RILP、ATP6V0D1蛋白的患者相比,低表达RILP、ATP6V0D1蛋白的肺癌患者生存期短(P<0.05)。STRING数据库结果显示RILP蛋白与微管蛋白TUBB/TUBA1A以及自噬相关蛋白LC3Ⅱ相互作用。同时,TCGA数据库显示在肺腺癌和肺鳞癌组织中,RILP蛋白与ATP6V0D1蛋白的表达呈正相关(P<0.01),RILP蛋白与LC3Ⅱ蛋白的表达呈正相关(P<0.01),ATP6V0D1蛋白与LC3Ⅱ蛋白的表达呈正相关(P<0.01)。结论SFN通过上调RILP的表达,从而加强RILP与溶酶体ATP6V0D1蛋白及LC3Ⅱ的关联,抑制非小细胞肺癌细胞自噬溶酶体形成。